時(shí)間：2022-05-09 05:50:35
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摘要：本文對(duì)固定化微生物和游離菌凈化SO2的性能進(jìn)行了初步對(duì)比實(shí)驗(yàn)研究，分別測(cè)試了固定化微生物與游離菌在液相和氣相環(huán)境中對(duì)SO2的凈化性能，同時(shí)考察了在氣相條件下二者對(duì)SO2的凈化效果。實(shí)驗(yàn)表明，利用復(fù)合固定化方法即吸附—包埋—交聯(lián)法制備的固定化小球，與游離菌相比，對(duì)SO2的凈化性能有顯著提高。
關(guān)鍵詞：固定化微生物 二氧化硫 降解
0 引 言
我國(guó)是以煤為主要能源的國(guó)家。1990年煤在一次能源中占76.2%，2000年占70%，預(yù)計(jì)2050年仍占60~70%[1]，這表明我國(guó)以煤為主要能源結(jié)構(gòu)在今后相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)不會(huì)改變。
我國(guó)煤炭大多數(shù)都直接燃燒，因此造成煙塵和SO2等污染物大量排放到環(huán)境中，導(dǎo)致我國(guó)城市的空氣污染十分嚴(yán)重。造成了嚴(yán)重的酸雨污染和生態(tài)損害。根據(jù)有關(guān)研究，1995年我國(guó)由于酸雨和SO2污染造成農(nóng)作物、森林和人體健康等方面的經(jīng)濟(jì)損失為1100多億，已接近當(dāng)年國(guó)民生產(chǎn)總值到2.0%[2]。如不嚴(yán)格控制，SO2問(wèn)題將成為制約我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會(huì)發(fā)展的重要因素，因此，削減和控制燃煤SO2污染是我國(guó)能源和環(huán)境保護(hù)面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。
早在50年代，Leathan等（1953年）及Temple等（1954年）就分別發(fā)現(xiàn)某些化能自養(yǎng)型細(xì)菌與煤中FeS2的氧化有關(guān)，并從煤礦廢水中分離出氧化亞鐵硫桿菌（Thiobacilus ferroxidans）[3]。然而，當(dāng)時(shí)，此發(fā)現(xiàn)并未引起足夠的重視，直至70年代，因世界范圍的大氣污染和酸雨問(wèn)題日益嚴(yán)重，世界各國(guó)才開(kāi)始重視與煤炭脫硫有關(guān)的微生物研究。
微生物脫硫是利用化能自養(yǎng)微生物對(duì)SOX的代謝過(guò)程，將煙道氣中的硫氧化物脫除。在生物脫硫過(guò)程中，氧化態(tài)的污染物如SO2，硫酸鹽、亞硫酸鹽及硫代硫酸鹽經(jīng)微生物還原作用生成單質(zhì)硫去除[4]。目前，傳統(tǒng)的生化處理存在著生物濃度低，會(huì)產(chǎn)生大量的污泥，并且給后處理帶來(lái)麻煩，同時(shí)占地面積大，投資高、動(dòng)力消耗多等問(wèn)題。這些問(wèn)題采用傳統(tǒng)方法不能解決，而固定化微生技術(shù)卻展現(xiàn)了廣闊的前景[5-6]
固定化微生物技術(shù)即固定化細(xì)胞技術(shù)，是20世紀(jì)60年代開(kāi)始迅速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù) ，它是通過(guò)化學(xué)的或物理的手段將游離細(xì)胞或酶定位于限定的空間區(qū)域內(nèi)，使其保持活性并可以反復(fù)利用[7]。固定化微生物技術(shù)最初主要用于發(fā)酵生產(chǎn)，70年代后期，被用到水處理領(lǐng)域，近年來(lái)則成為各國(guó)學(xué)者研究的熱點(diǎn)。固定化生物技術(shù)克服了生物細(xì)胞太小，與水溶液分離較難，易造成二次污染的弊端，具有微生物密度高、反應(yīng)迅速、微生物流失少、產(chǎn)物易分離、反應(yīng)過(guò)程易控制等優(yōu)點(diǎn)，是一種很有前途的污染物處理技術(shù)[8-10]。采用固定化技術(shù)可以使微生物封閉在載體內(nèi)，減少菌體的脫落，同時(shí)微生物在載體內(nèi)可以繁殖，當(dāng)酶失去活性后，通過(guò)培養(yǎng)可恢復(fù)其活性而被反復(fù)利用[11]。
近年來(lái)，隨著世界經(jīng)濟(jì)的發(fā)展及工業(yè)的進(jìn)步，環(huán)境問(wèn)題已成為全球性問(wèn)題，固定化微生物技術(shù)作為一種新的處理方法，已成為生物工程和環(huán)境工程技術(shù)的一個(gè)重要分支，越來(lái)越受到人們的重視。固定化微生物法凈化低濃度煙氣SO2技術(shù)的研究不僅拓展了生物技術(shù)在廢氣治理領(lǐng)域的研究與應(yīng)用，而且為低濃度煙氣SO2的生物治理提供了一個(gè)新途徑。因此本研究對(duì)固定化微生物與游離菌凈化SO2的性能的進(jìn)行了對(duì)比，以確認(rèn)固定化微生物法凈化SO2的可行性。
1 實(shí)驗(yàn)條件與方法
1.1菌種培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)裝置
本馴化實(shí)驗(yàn)中所使用的菌種溶液為某污水處理廠氧化溝中段的污水，采用誘導(dǎo)馴化方式對(duì)菌種進(jìn)行馴化，即向菌液中每日通入一定量的SO2氣體，并不斷地提高SO2氣體的量，使微生物逐步適應(yīng)并經(jīng)多代繁衍。經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的馴化后，分析菌種對(duì)液相中亞硫酸根的降解性能，來(lái)判斷菌種對(duì)SO2的凈化性能。實(shí)驗(yàn)裝置如圖1所示。
Fig.1 experimental equipment of training microbe
圖中1、2、3為SO2氣體發(fā)生裝置，即H2SO4溶液和Na2SO3溶液在3中反應(yīng)生成SO2氣體，并在風(fēng)機(jī)的作用下，將氣體吹入裝有菌液的馴化裝置6。
1.2固定化微生物制備方法
常用的固定化制備方法可分為三種：吸附法、交聯(lián)法和包埋法[12]?，F(xiàn)分述如下：
1)吸附法
吸附法是通過(guò)靜電吸引或利用載體對(duì)細(xì)胞的親和性將細(xì)胞直接吸附在水不溶性載體上。一般只要把載體放在細(xì)胞懸浮液中攪拌或浸泡，然后洗去沒(méi)有被吸附的游離細(xì)胞，就制成了固定化細(xì)胞。該法操作簡(jiǎn)單，對(duì)細(xì)胞活性影響小，但所能固定的細(xì)胞數(shù)量有限。吸附法分為物理吸附和離子吸附兩種。
2)交聯(lián)法
交聯(lián)法不使用載體，是利用雙功能或多功能試劑直接與細(xì)胞表面的基團(tuán)如氨基、烴基等進(jìn)行交聯(lián)，使細(xì)胞之間相互接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。最常用的交聯(lián)劑有戊二醛，順丁烯二酸酐、甲苯二異氰酸酯等。此法化學(xué)反應(yīng)激烈，對(duì)細(xì)胞活性影響大。另外，交聯(lián)劑大多價(jià)格昂貴，限制了它的廣泛應(yīng)用。
3)包埋法
包埋法是將細(xì)胞包裹在凝膠的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)中或者包裹在半透性聚合薄膜內(nèi)，小分子的底物和產(chǎn)物可以自由擴(kuò)散，而細(xì)胞卻不會(huì)擴(kuò)散到周圍介質(zhì)中去。包埋的載體主要有聚丙烯酰胺、瓊脂、明膠、K—卡拉膠和海藻酸鈣等。包埋法的優(yōu)點(diǎn)在于包埋方法簡(jiǎn)單、條件溫和，可以保持較高的細(xì)胞酶活力，是應(yīng)用最為廣泛的細(xì)胞固定化方法之一[12]。
根據(jù)本課題組的前期實(shí)驗(yàn)，增加活性炭的投加量，可使固定化微生物小球的活性和耐酸性均有不同程度的提高，但機(jī)械強(qiáng)度基本不變。增加己二胺的投加量，使小球的相對(duì)活性、機(jī)械強(qiáng)度和耐酸性均有不同程度的增加；交聯(lián)時(shí)間增加也會(huì)使小球的機(jī)械強(qiáng)度增強(qiáng)。通過(guò)本研究前期正交實(shí)驗(yàn)確定的固定化小球最佳制備工藝，來(lái)制備固定化微生物。
本課題的前期實(shí)驗(yàn)研究，分別選用三種復(fù)合固定化方法中的最佳條件和包埋法最佳固定條件，制備固定化微生物小球，其性能比較結(jié)果如表1所示[13]。
固定方法性能指標(biāo) 海藻酸鈉包埋法 吸附—包埋復(fù)合固定法 包埋—交聯(lián)復(fù)合固定法 吸附—包埋—交聯(lián)法 相對(duì)活性% 225.6 261.9 221.3 246.2 機(jī)械強(qiáng)度g 27 27 40 42 72h失重率% 36.3 31.7 36.0 28
該結(jié)果證明采用復(fù)合固定方法即吸附—交聯(lián)—包埋復(fù)合固定法制備固定化小球，不僅保證了固定化微生物很高的相對(duì)活性，而且還提高了固定化小球的機(jī)械強(qiáng)度及耐酸性。因此本研究采用復(fù)合固定方法即吸附—交聯(lián)—包埋復(fù)合固定法，以如圖2所示的工藝流程來(lái)制備固定化微生物。
圖2 固定化微生物制備工藝流程圖
Fig.2 Flow chart of making immobilized microbial biomass
1.3固定床反應(yīng)器
以實(shí)驗(yàn)室制備的含SO2氣體為處理對(duì)象，將固定化微生物小球填充在固定床內(nèi)，對(duì)其中的SO2氣體行生化處理，其整套凈化實(shí)驗(yàn)裝置流程如圖3所示。
整個(gè)流程包括SO2氣體的發(fā)生系統(tǒng)和凈化SO2氣體的固定床生化反應(yīng)器二個(gè)部分。實(shí)驗(yàn)中，SO2氣體是通過(guò)Na2SO3溶液1和稀H2SO4溶液2在SO2氣體發(fā)生器3內(nèi)反應(yīng)制得的，并利用風(fēng)機(jī)4將發(fā)生器內(nèi)所生成的SO2氣體由底部直接吹入固定床生化反應(yīng)器。循環(huán)液體由高位槽7進(jìn)入6內(nèi)并從頂部向下噴淋到固定化微生物小球上（噴淋液體的主要作用是潤(rùn)濕固定化微生物小球，向微生物提供生長(zhǎng)所需要的氮磷等營(yíng)養(yǎng)物，同時(shí)將微生物的代謝產(chǎn)物帶走），而后由反應(yīng)器底部排入循環(huán)水槽8，再由耐酸泵9打回到高位槽循環(huán)使用。SO2氣體在塔內(nèi)上升的過(guò)程中與固定化微生物接觸而被吸收，凈化后的氣體由反應(yīng)器頂部排出。為了避免造成污染，在尾氣排空前設(shè)置了SO2尾氣吸收瓶10。
1.4實(shí)驗(yàn)分析方法
氣相中SO2和液相中SO32-的分析方法采用碘量法。用奧立龍818型精密酸度計(jì)測(cè)液相pH值。
2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
2.1在液相環(huán)境中凈化SO2能力隨時(shí)間的變化比較
將一定濃度的SO32-溶液中分別加入含有等量微生物的固定化微生物和游離菌，每隔一段時(shí)間測(cè)定溶液中SO32-濃度，并計(jì)算出凈化效率。如圖4所示，曝氣量為0.1m3/h時(shí)，固定化小球的凈化速率大于游離菌的，在反應(yīng)開(kāi)始進(jìn)行的20分鐘內(nèi)，固定化小球的凈化速率是增大的，游離菌的基本不變；20min以后，二者的凈化速率都呈下降趨勢(shì)。在生化反應(yīng)的有效時(shí)間內(nèi)，固定化小球的凈化速率高于游離菌的。這表明固定化微生物凈化SO2的性能優(yōu)于游離菌的性能。
2.2 在不同pH值的液相環(huán)境下對(duì)SO2凈化性能的比較
因?yàn)镾O2為酸性氣體，所以只研究在偏酸性環(huán)境下固定化微生物和游離菌對(duì)SO2的凈化效率。選擇從pH=3到pH=6四個(gè)pH值作為實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，用NaOH溶液和鹽酸溶液來(lái)調(diào)節(jié)其液相環(huán)境的pH值，考慮到NaOH溶液會(huì)消耗SO2，因此將pH值調(diào)節(jié)好后液相中SO32-的濃度作為SO2的初始濃度，測(cè)試游離菌與固定化微生物凈化SO2的效率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。
圖5顯示固定化小球的凈化效率明顯高于游離菌的，pH=5時(shí)固定化小球的凈化效率高達(dá)70%，而游離菌的只有30%。這也表明固定化微生物對(duì)SO2的凈化性能優(yōu)于游離菌的凈化性能。
Fig.4 Changing of purification velocity with increasing of time
Fig.5 Effect of pH on purification efficiency
2.3 固定化微生物與游離菌凈化SO2氣體的性能對(duì)比研究
將固定化小球裝入如圖3所示的固定床6中，制得的SO2氣體由風(fēng)機(jī)吹入反應(yīng)器6，在G處測(cè)入口濃度，在改變?nèi)肟跐舛鹊臈l件下測(cè)固定化微生物的凈化效率。在相同的條件下將SO2氣體通入菌液中，在相同的時(shí)刻測(cè)菌液中SO32-濃度和出口SO2濃度，計(jì)算出其凈化效率，結(jié)果如圖6所示。當(dāng)入口濃度為5.1 g/m3時(shí)，固定化微生物和游離菌的凈化效率都為98%。但隨著入口SO2氣體濃度的增大，游離菌的凈化效率急劇下降。當(dāng)入口氣體濃度為7.2g/m3時(shí)，游離菌的凈化效率只有40.7%，而固定化微生物的凈化效率仍保持在80%以上。二者的凈化效率都隨著入口濃度的增大而降低，其原因主要是當(dāng)入口濃度較低時(shí)，微生物可以和SO2氣體充分接觸，進(jìn)而被生化吸收。隨著入口SO2濃度的增加，多余的SO2在較短的時(shí)間內(nèi)未能被微生物吸收凈化，而是隨著氣相主體排出。因此就出現(xiàn)了隨著入口SO2濃度的增加其凈化效率反而下降的現(xiàn)象。
但是，如圖6所示，固定化小球的SO2凈化效率高于游離菌的。其原因主要是因?yàn)椴捎玫氖呛醚跷⑸?，固定化微生物可以與氣相接觸，即可耗用連續(xù)相的氣相中的氧來(lái)對(duì)SO2進(jìn)行生化吸收，而游離菌主要耗用的是液相中數(shù)量有限的溶解氧。因此富氧的反應(yīng)氣氛是固定化微生物凈化效果優(yōu)于游離菌凈化效果的一個(gè)重要原因。
3結(jié)論
本研究對(duì)固定化微生物與游離菌凈化SO2的對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)固定化后的微生物在液相和氣相環(huán)境中均對(duì)SO2有較強(qiáng)的凈化去除作用，其凈化性能明顯優(yōu)于游離菌的凈化性能，因此有繼續(xù)開(kāi)展深入研究的價(jià)值和必要。
論文關(guān)鍵詞:產(chǎn)酸發(fā)酵反應(yīng)器 生態(tài)因子 頂極群落 生態(tài)演替 生態(tài)位
論文摘要:通過(guò)產(chǎn)酸發(fā)酵反應(yīng)器的動(dòng)態(tài)試驗(yàn),考察生態(tài)因子(pH、ORP)等制約的不同發(fā)酵類型頂極群落的結(jié)構(gòu)、優(yōu)勢(shì)種群的組成和生態(tài)演替的規(guī)律,闡明不同發(fā)酵類型代謝及其頂極群落的典型特征,揭示產(chǎn)酸發(fā)酵過(guò)程中頂極群落內(nèi)平衡與反饋調(diào)節(jié)的生理代謝機(jī)制,并以pH值、ORP來(lái)表征生態(tài)演替過(guò)程中優(yōu)勢(shì)種群的生態(tài)位圖。
Ghosh和Poland在1971年提出了利用相分離的原理:分別控制適應(yīng)于產(chǎn)酸發(fā)酵菌和產(chǎn)甲烷菌的最佳生理及生態(tài)條件,從而形成具有較高運(yùn)行穩(wěn)定性和處理效率的兩相厭氧生物處理系統(tǒng)。目前,對(duì)于兩相厭氧生物處理的微生物生態(tài)學(xué)的研究普遍受到重視,但是由于產(chǎn)甲烷菌具有種類少、生長(zhǎng)繁殖慢、利用底物種類有限、對(duì)環(huán)境條件敏感等特性,使得人們長(zhǎng)久以來(lái)認(rèn)為產(chǎn)甲烷相是兩相厭氧處理系統(tǒng)中的關(guān)鍵“限速步驟”,因此大多數(shù)研究集中于產(chǎn)甲烷相微生物的生態(tài)學(xué)研究上。事實(shí)上產(chǎn)酸相不同生態(tài)條件下形成的末端發(fā)酵產(chǎn)物作為產(chǎn)甲烷細(xì)菌利用的底物,對(duì)產(chǎn)甲烷相乃至整個(gè)工藝的穩(wěn)定運(yùn)行具有至關(guān)重要的作用[1]。以往的研究表明,產(chǎn)甲烷相微生物對(duì)底物的轉(zhuǎn)化速率依次為乙醇>戊酸>丁酸>乙酸>丙酸,而乙酸的轉(zhuǎn)化是系統(tǒng)產(chǎn)甲烷即去除效率的“限速步驟”。從整個(gè)系統(tǒng)角度出發(fā),產(chǎn)酸相最佳發(fā)酵類型應(yīng)為乙醇型發(fā)酵[2]。因此利用連續(xù)流產(chǎn)酸發(fā)酵反應(yīng)器,通過(guò)對(duì)限制性因子(pH、ORP)的調(diào)控,考察在人工創(chuàng)建生境中,微生物所遵循的群落與種群生態(tài)學(xué)演替規(guī)律,不同發(fā)酵類型的頂級(jí)群落內(nèi)平衡與反饋調(diào)節(jié)的生理代謝機(jī)制,得出以pH、ORP表征的生態(tài)演替過(guò)程中優(yōu)勢(shì)種群的三維實(shí)現(xiàn)生態(tài)位,這對(duì)于進(jìn)一步闡明產(chǎn)酸相不同發(fā)酵類型的生態(tài)學(xué)規(guī)律,提高兩相厭氧的整體處理水平具有新的思路和理論指導(dǎo)意義。
1 試驗(yàn)材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)裝置
采用沉淀區(qū)和反應(yīng)區(qū)一體化、內(nèi)設(shè)氣—液—固三相分離裝置的連續(xù)流攪拌槽式厭氧反應(yīng)器(CSTR)作為產(chǎn)酸相反應(yīng)器,有效容積為3.1L,通過(guò)對(duì)pH、ORP進(jìn)行調(diào)控進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn);反應(yīng)器外部纏繞電熱絲結(jié)合溫控儀保證內(nèi)部溫度(30±1℃)的厭氧條件,實(shí)驗(yàn)中控制COD負(fù)荷為8kg/m3·d,進(jìn)水COD濃度為4000mg/L。具體流程見(jiàn)圖1所示。
1.2 實(shí)驗(yàn)底物與分析方法
采用廢糖蜜為底物,并按照COD∶N∶P=800~1000∶5∶1配以少量N、P。采用標(biāo)準(zhǔn)方法分析測(cè)定COD、pH、ORP(以電極電位Eh計(jì),mV)。液相發(fā)酵產(chǎn)物采用SC-7氣相色譜分析儀,按照任南琪[1](1994)建立的檢測(cè)方法進(jìn)行分析。厭氧細(xì)菌的培養(yǎng)采用改進(jìn)的Hungate技術(shù),鑒定方法參見(jiàn)參考文獻(xiàn)[3]。
2 結(jié)果與討論
產(chǎn)酸發(fā)酵類型指依據(jù)酸性末端產(chǎn)物中揮發(fā)性脂肪酸(VFA)的分布判斷微生物的生理代謝途徑。酸性末端產(chǎn)物中始終占據(jù)主導(dǎo)地位的物質(zhì)定義為相應(yīng)的代謝類型,并將產(chǎn)酸發(fā)酵生態(tài)系統(tǒng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)時(shí)代謝的優(yōu)勢(shì)種群定義為頂極群落。產(chǎn)酸相的三種發(fā)酵類型中,丁酸型發(fā)酵和丙酸型發(fā)酵分別以丁酸或丙酸為主要液相末端發(fā)酵產(chǎn)物,而乙醇型發(fā)酵的主要液相末端產(chǎn)物為乙醇和乙酸。
生態(tài)演替是生物群落的一個(gè)動(dòng)態(tài)變化特性,具有定向性、可調(diào)控性、趨于穩(wěn)定性。由于環(huán)境因素(因變因子:pH、ORP)、微生物內(nèi)部群落及末端代謝產(chǎn)物組成的協(xié)調(diào)控制,產(chǎn)酸相微生物群落在隨環(huán)境因素定向演替的同時(shí),由于群落的內(nèi)平衡和反饋調(diào)節(jié)機(jī)制,又保持了相對(duì)的穩(wěn)定性,即形成與不同發(fā)酵類型相對(duì)應(yīng)的特征頂級(jí)群落生態(tài)系統(tǒng),頂級(jí)群落中微生物通過(guò)種間競(jìng)爭(zhēng)和協(xié)同作用選擇優(yōu)勢(shì)種群,形成復(fù)雜的生態(tài)學(xué)決定關(guān)系[4~5](圖2)。
2.1 乙醇型頂極群落的結(jié)構(gòu)模式及生態(tài)演替
產(chǎn)酸發(fā)酵反應(yīng)器的乙醇型發(fā)酵是以H2為主要?dú)庀喈a(chǎn)物,乙醇、乙酸為主要液相產(chǎn)物的發(fā)酵類型,在ORP、pH特別低的情況下,以產(chǎn)生乙醇的方式保證細(xì)胞內(nèi)部的正常pH值,以維持機(jī)體正常產(chǎn)能和合成代謝,同時(shí)每產(chǎn)生1mol乙醇,氧化NADH的量為2mol,以此實(shí)現(xiàn)NAD+/NADH的耦聯(lián),并產(chǎn)生1mol氫氣見(jiàn)表1。乙醇型發(fā)酵具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性,不同反應(yīng)器及不同運(yùn)行階段的乙醇型發(fā)酵微生物優(yōu)勢(shì)菌群見(jiàn)表2。
2.2 丙酸型頂極群落的結(jié)構(gòu)模式及生態(tài)演替
丙酸的產(chǎn)生和積累對(duì)厭氧生物處理系統(tǒng)有重要的影響,導(dǎo)致系統(tǒng)pH降低而發(fā)生“酸化”,致使產(chǎn)甲烷菌失活[6]。主要原因是丙酸在產(chǎn)甲烷相的產(chǎn)乙酸過(guò)程緩慢。丙酸型發(fā)酵的典型細(xì)菌丙酸桿菌屬無(wú)氫化酶,不產(chǎn)生氫氣。丁酸型發(fā)酵的主要限制性因素為較高的ORP和pH5.0。不同反應(yīng)器及不同運(yùn)行階段的丙酸型發(fā)酵的頂級(jí)群落中優(yōu)勢(shì)種群見(jiàn)表3。
2.3 丁酸型頂極群落的結(jié)構(gòu)模式及生態(tài)演替
從微生物代謝角度講,pH接近中性時(shí)細(xì)菌以合成代謝為主,數(shù)量的增殖增加了ATP的消耗量,而丁酸型發(fā)酵的單位ATP產(chǎn)量是3,因此被選擇。在環(huán)境中ORP較低、pH為6.0和5.0左右發(fā)生的是丁酸型發(fā)酵。而較高ORP、pH為5.0時(shí)的丙酸型發(fā)酵是由于丙酸桿菌的兼性需氧性所致。不同反應(yīng)器及不同運(yùn)行階段的丁酸型發(fā)酵的頂級(jí)群落中優(yōu)勢(shì)種群見(jiàn)表4。按照Odum生態(tài)學(xué)的觀點(diǎn)分析,在調(diào)節(jié)pH、ORP的生態(tài)演替過(guò)程中,環(huán)境中的頂極群落受環(huán)境中生態(tài)因子的制約而呈現(xiàn)一定的演替過(guò)程,最終被環(huán)境條件所選擇的微生物成為優(yōu)勢(shì)菌群,這是群落“進(jìn)化”過(guò)程中功能由量變到質(zhì)變的過(guò)程,這一過(guò)程包括以下階段:(1)各種發(fā)酵類型微生物之間復(fù)雜的種群關(guān)系通過(guò)微生物的生理代謝調(diào)節(jié)作用,與生境相適應(yīng)的優(yōu)勢(shì)種群得以生長(zhǎng)繁殖;(2)同種發(fā)酵類型微生物頂極群落的內(nèi)平衡與反饋調(diào)節(jié)能力;(3)不同發(fā)酵類型代謝末端產(chǎn)物對(duì)群落的制約、調(diào)控;(4)頂極群落中某些優(yōu)勢(shì)種群(如2）反應(yīng)器的擬桿菌屬)的生態(tài)位與反應(yīng)器內(nèi)生態(tài)條件相似,污泥馴化初期已是優(yōu)勢(shì)種群,其優(yōu)勢(shì)地位不易動(dòng)搖。
2.4 演替過(guò)程中優(yōu)勢(shì)種群的生態(tài)位
圖4所示是以O(shè)RP、pH值組成的產(chǎn)酸相不同發(fā)酵類型頂極群落中優(yōu)勢(shì)種群的二維實(shí)現(xiàn)生態(tài)位圖。由圖3可見(jiàn),生態(tài)因子制約了優(yōu)勢(shì)種群的生態(tài)演替,在這一過(guò)程中,各種類型微生物為形成穩(wěn)定的頂極群落,通原因。膜組件的材料、MBR的運(yùn)行條件和活性污泥的性質(zhì)決定了這些因素的影響程度。(3)通過(guò)合理的設(shè)計(jì)及優(yōu)化運(yùn)行條件,結(jié)合有效的反沖洗和清洗措施,能夠最大限度地控制膜污染和恢復(fù)膜通量。
【關(guān)鍵詞】 滅菌
摘要：目的：評(píng)價(jià)可拆卸腹腔鏡器械的滅菌效果。方法：將兩種腹腔鏡器械認(rèn)真徹底清洗后，用同一方法滅菌后進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢測(cè)。結(jié)果：可拆卸腹腔鏡器械的滅菌后細(xì)菌學(xué)檢測(cè)合格率達(dá)100%，不可拆卸腹腔鏡器械的滅菌后細(xì)菌學(xué)檢測(cè)合格率達(dá)僅占87.54%。結(jié)論：可拆卸的腹腔鏡器械滅菌效果達(dá)標(biāo)，為確保醫(yī)療安全，建議購(gòu)買可拆卸的腹腔鏡器械。
關(guān)鍵詞：腹腔鏡器械；可拆卸；不可拆卸；滅菌；檢測(cè)
《消毒技術(shù)規(guī)范》中規(guī)定腹腔鏡器械用前必須達(dá)到滅菌水平［1］。目前市面上有兩類不同的腹腔鏡器械即不可拆卸和可拆卸的腹腔鏡手術(shù)器械。為評(píng)價(jià)兩種不同腹腔鏡手術(shù)器械的滅菌效果，在2003年7月至2004年12月期間，將不可拆卸與可拆卸腹腔鏡手術(shù)器械進(jìn)行滅菌效果檢測(cè)，比較二者的滅菌效果。
1 材料和方法
1.1 材料及設(shè)備：選擇常用的腹腔鏡手術(shù)器械如抓鉗、分離鉗、鈦夾鉗、腸鉗、持針器、薄剪、鉤剪、雙極電凝等不可拆卸和可拆卸的腹腔鏡器械共659件次；滅菌器用廣州匯日醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn)的WAYWIN?2000醫(yī)用滅菌器及其配機(jī)專用的消毒劑（過(guò)醋酸和水楊酸）和超聲清洗機(jī)；Elecsys 2010電化學(xué)發(fā)光儀由瑞士羅氏公司提供。VITEK-2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)由法國(guó)梅里埃公司提供；生物學(xué)監(jiān)測(cè)滅菌效果用枯草桿菌黑色變種芽胞（ATCC9372）；洗滌劑用美國(guó)強(qiáng)生公司生產(chǎn)的適酶洗滌劑；吹干器械用高壓氣槍；純抗原HbsAg（1.5mg/ml）由廣東省臨檢中心提供。
1.2 器械的清洗：先用流水沖凈腹腔鏡手術(shù)器械的肉眼可見(jiàn)污物，再將所有腹腔鏡器械用0.8%的適酶溶液超聲清洗30min?？刹鹦兜母骨荤R器械在清洗前先將器械的各個(gè)關(guān)節(jié)部位全部打開(kāi)，將操作桿套管、管蕊分離，使內(nèi)管道及管蕊裸露。
1.3 不可拆卸腹腔鏡器械的清洗：因不可拆卸腹腔鏡器械的特殊構(gòu)造，不能拆開(kāi)器械的各關(guān)節(jié)及內(nèi)管蕊等，所關(guān)節(jié)和內(nèi)管腔等部位較難清潔。用超聲清洗器洗完后，只能靠人手用刷子、針頭或尖刀刷洗和挑去夾縫中的污物等，流動(dòng)水認(rèn)真仔細(xì)清洗器械的各個(gè)部位，然后用流水沖洗，再用高壓氣槍吹干。
1.4 可拆卸腹腔鏡器械的清洗：用超聲清洗器洗完后，人手用毛刷子流動(dòng)水下清洗各個(gè)部位后，用高壓氣槍吹干。
1.5 器械的滅菌：將兩種腹腔鏡器械同時(shí)放入同一爐WAYWIN?2000醫(yī)用滅菌器內(nèi)，按操作程序進(jìn)行滅菌；每次均按要求放入枯草桿菌黑色變種芽胞（ATCC9372）進(jìn)行生物學(xué)監(jiān)測(cè)。
1.6 器械滅菌后的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)：標(biāo)本采集：將滅菌后腹腔器械前端（接觸病人端）按無(wú)菌操作放入10ml無(wú)菌洗脫液內(nèi)反復(fù)活動(dòng)關(guān)節(jié)15次后［3］送檢，并均作陽(yáng)性對(duì)照。按《消毒技術(shù)規(guī)范》醫(yī)療器械滅菌效果的監(jiān)測(cè)要求進(jìn)行檢測(cè)［4］。在2001年7月至2002年12月期間共滅菌了102爐次，共檢測(cè)了659份標(biāo)本。
2 結(jié)果
兩類腹腔鏡手術(shù)器械的滅菌效果（見(jiàn)表1）；每爐的枯草桿菌黑色變種芽胞生物指示劑經(jīng)檢測(cè)均符合要求。
表1 兩類腹腔鏡手術(shù)器械的滅菌后細(xì)菌學(xué)檢測(cè)結(jié)果 略
3 討論
3.1 從表可知，可拆卸的腹腔鏡器械滅菌合格率為100%。不可拆卸的腹腔鏡器械的滅菌合格率僅有87.54%，檢出的細(xì)菌中有致病性和耐藥性均強(qiáng)的銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌，可引起難愈性術(shù)后感染，不符合滅菌物品的要求（必須達(dá)到100%）［5］。兩者都未檢出病毒。由此可見(jiàn)，為保證腹腔鏡手術(shù)器械的滅菌效果，避免發(fā)生醫(yī)院內(nèi)感染，確保醫(yī)療安全，應(yīng)該選用可拆卸的腹腔鏡手術(shù)器械。
3.2 清洗徹底是保證消毒或滅菌成功的關(guān)鍵［6］。而《消毒技術(shù)規(guī)范》中要求腹腔鏡器械應(yīng)達(dá)到滅菌水平。為確保滅菌效果，器械的各個(gè)部件都應(yīng)便于拆卸和互換，同時(shí)強(qiáng)調(diào)清洗器械時(shí)，要對(duì)器械進(jìn)行徹底拆卸、清洗［7］。腹腔鏡手術(shù)器械。
3.3 比普通手術(shù)器械的構(gòu)造復(fù)雜、精細(xì)，有細(xì)小的內(nèi)腔。不可拆卸的腹腔鏡手術(shù)器械，由于無(wú)沖洗管、無(wú)法拆開(kāi)各關(guān)節(jié)及部件，較難清洗到關(guān)節(jié)部位及內(nèi)腔，手術(shù)時(shí)反吸的血污較難清洗干凈，極易殘留污物和細(xì)菌。WAYWIN?2000醫(yī)用滅菌器是通過(guò)三層過(guò)濾的無(wú)菌水加上專用滅菌劑（過(guò)醋酸和水楊酸者）充分接觸而達(dá)到滅菌。但由于器械的不可拆卸，滅菌時(shí)器械的某些部位無(wú)法與滅菌劑接觸，存在盲點(diǎn)，而導(dǎo)致器械殘留或滋長(zhǎng)細(xì)菌，存在醫(yī)療安全隱患。
3.4 可拆卸的腹腔鏡器械，可將器械的操作桿套管、管蕊及手柄等關(guān)節(jié)部位拆開(kāi)裸露，清洗方便、徹底。滅菌時(shí)器械的各個(gè)部位均能與滅菌劑充分接觸，不存在盲點(diǎn)，這應(yīng)是可拆卸腹腔鏡手術(shù)器械經(jīng)細(xì)菌學(xué)檢測(cè)全部無(wú)菌生長(zhǎng)的主要原因之一。
3.5 我國(guó)自1991年開(kāi)展腹腔鏡手術(shù)，在10多年的時(shí)間里，腹腔鏡外科由于創(chuàng)傷小、痛苦少、恢復(fù)快等眾所周知的特點(diǎn)，以異常迅猛的速度得到了發(fā)展［8］，許多醫(yī)院都先后開(kāi)展了腹腔鏡手術(shù)。但由于各家醫(yī)院的經(jīng)濟(jì)條件不同，所購(gòu)買的器械檔次也不同。為了保證腹腔鏡器械的滅菌效果，確保醫(yī)療安全，筆者建議，不管購(gòu)買何種檔次的器械，應(yīng)購(gòu)買可拆卸的腹腔鏡手術(shù)器械，以方便清洗和保證滅菌效果，確保醫(yī)療安全?，F(xiàn)有不可拆卸的腹腔鏡手術(shù)器械，由于價(jià)格較貴，且性能完好，只能逐步淘汰，不可能隨便丟棄。建議此類器械采用2%戊二醛浸泡10h，使用前用無(wú)菌水徹底沖洗干凈再使用。此方法滅菌效果經(jīng)檢測(cè)合格率可達(dá)100%，能符合要求（另文論述），確保腹腔鏡手術(shù)器械安全使用。
【摘要】 歸納了纖溶酶原的空間結(jié)構(gòu)和纖溶酶原的活化在血栓溶解上的重要作用，分析了低分子化合物通過(guò)改變纖溶酶原空間結(jié)構(gòu)促進(jìn)血栓溶解的機(jī)理。重點(diǎn)敘述了到目前為止發(fā)現(xiàn)的complestatin,chloropeptin Ⅰ,stablabin,sarfuctin,glucosyldiacylglycerol等幾類具有促進(jìn)纖溶作用的低分子天然化合物和它們各自的特性，并且敘述了這些化合物促進(jìn)纖溶作用的機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】 纖溶酶原；纖溶作用；低分了化合物
纖溶系統(tǒng)（纖溶酶原/纖溶酶系統(tǒng)）具有溶解血栓的作用，此外它還與創(chuàng)傷治療、組織再建、血管新生、炎癥反應(yīng)、排卵、癌的形成與轉(zhuǎn)移、動(dòng)脈硬化、病原菌的組織侵入等許多生理的、病理的變化過(guò)程相關(guān)［1，2］，纖維蛋白原是血液中的重要構(gòu)成蛋白質(zhì)，正常血漿的含量在2～4g/L，纖維蛋白原由3種線狀的糖蛋白分子所構(gòu)成，蛋白質(zhì)長(zhǎng)鏈通過(guò)二硫鍵結(jié)合在一起形成分子量為34萬(wàn)的纖維蛋白原大分子，以溶解狀態(tài)參與血液循環(huán)，通過(guò)血液凝固反應(yīng)，在凝血酶的作用下纖維蛋白原能被轉(zhuǎn)變成不溶的纖維蛋白（血栓）沉積在血管壁上。纖溶系統(tǒng)的纖溶酶原和纖溶酶原激活劑通過(guò)賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)與纖維蛋白相結(jié)合，在該結(jié)合部位形成的纖溶酶將纖維蛋白分解，纖溶酶原被兩種纖溶酶原激活劑（plasminogen activator,PA)尿激酶型纖溶酶原激活劑（urokinase-type plasminogen activator,uPA)和組織型纖溶酶原激活劑(tissue-type plasminogen activator,tPA)激活成具有活性的纖溶酶，該纖溶體系的活性以及纖溶酶原轉(zhuǎn)換成纖溶酶的變化過(guò)程被PA抑制劑PAL-1（plasminogen activator inhibitor 1)、α2-抗纖溶酶（α2-antiplasmin)所調(diào)節(jié)。
在血液凝固-纖溶體系，一些生理活性成分能夠通過(guò)（1）促進(jìn)非活化狀態(tài)的纖溶酶原向活化的纖溶酶的轉(zhuǎn)化；（2）提高纖溶酶原的血栓結(jié)合活性；（3）改變纖溶酶原的空間結(jié)構(gòu)使該酶原處于容易被纖溶酶原激活劑活化的狀態(tài)；（4）促進(jìn)血液中微量存在的尿激酶型纖溶酶原激活劑前體（prourokinase)向尿激酶型纖溶酶原激活劑的轉(zhuǎn)化從而開(kāi)始纖溶作用的爆發(fā)式血栓溶解反應(yīng)，來(lái)加快纖溶酶原向纖溶酶的轉(zhuǎn)化或促進(jìn)纖溶酶的纖維蛋白（血栓）酶解反應(yīng)過(guò)程，血管中因病理作用生成的血栓將被溶解并進(jìn)而消除血 栓癥。從天然化合物中探索針對(duì)于纖溶體系的酶原、酶的 特異性生理活性物質(zhì)作為血栓癥的治療藥物將不存在生理性的出血危險(xiǎn)性，并且會(huì)適用于慢性及早期血栓癥狀?；?于上述事實(shí)和理論基礎(chǔ)，利用纖溶體系的酶原［3，18］（plasminogen,prourokinase)、血栓構(gòu)筑的in vitro檢索體系從微生物和海藻的代謝產(chǎn)物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了纖溶酶原的活性促進(jìn)物質(zhì)如complestatin,staplabin,plactins,surfactin和尿激酶型纖溶酶原激活劑前體的內(nèi)因性活性促進(jìn)物質(zhì)glucosyldiacylglycerol等，這些化合物的促進(jìn)纖溶作用或者是剛被發(fā)現(xiàn)、或者是活性低等原因，離臨床應(yīng)用還需要作大量的研究。但由于低分子化合物在微血栓、慢性血栓和使用上的巨大潛力和安全性，在溶血栓藥物的研究領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)和研究低分子纖溶促進(jìn)化合物正在成為探索新型纖溶療法藥物的重要途徑。一些研究者在探索促進(jìn)纖溶作用的低分子天然化合物時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一些具有促進(jìn)纖溶作用的化合物，本文歸納了這些化合物的探索途徑、分離純化、特性和促進(jìn)纖溶作用的機(jī)制。
1 纖溶酶原的空間結(jié)構(gòu)和活化
在血液中循環(huán)的纖溶酶原（Glu1-plasminogen;Glu-Plg)具有閉合的空間結(jié)構(gòu)，在血液中被纖溶酶原激活劑低效率的活化［4，5］，這種閉合型的空間結(jié)構(gòu)被存在于N末端80個(gè)殘基（N-terminal peptide,NTP)中的賴氨酸殘基（Lys50或Lys60）與存在于第5個(gè)鏈回環(huán)（K5）上的氨基已糖結(jié)合位點(diǎn)形成分子內(nèi)結(jié)合鍵所維持［5，6］，當(dāng)?shù)?個(gè)鏈回環(huán)上的氨基已糖結(jié)合位點(diǎn)與纖維蛋白（或細(xì)胞受體）相結(jié)合時(shí)，NTP-K5的相互作用被解除，纖溶酶原分子被轉(zhuǎn)變成開(kāi)放型的結(jié)構(gòu)，纖溶酶原分子在空間馳豫，從而裸露在纖維蛋白（血栓）表面的賴氨酶殘基與纖溶酶原上顯露出來(lái)的賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合后，在空間馳豫的纖溶酶原被結(jié)合到纖維蛋白表面，纖溶酶原進(jìn)一步被存在于其附近的組織型纖溶酶原激活劑（t-PA)高效率的轉(zhuǎn)變成纖溶酶。由于纖溶酶原其分子結(jié)構(gòu)上的閉合狀態(tài)與開(kāi)放狀態(tài)的轉(zhuǎn)化特性（圖1），在纖維蛋白（或是細(xì)胞間質(zhì)）上，纖溶酶原的活性表現(xiàn)出是局域性的，血栓（纖維蛋白）溶解最先開(kāi)始于賴氨酸殘基的周圍，其作用機(jī)理如圖2所示。另外，隨著纖溶的進(jìn)行，Glu-Plg的N末端短肽被絲氨酸蛋白酶纖溶酶所切斷，Lys78-plasminogen (Lys-Plg)在纖溶酶所出現(xiàn)的區(qū)域產(chǎn)生，Lys-Plg分子由于不帶有NTP-K5分子內(nèi)結(jié)合鍵，所以是開(kāi)放型構(gòu)造，容易活化，并且通過(guò)高親和性與纖維蛋白結(jié)合。低分子化合物ε-氨基已酸（epsilon-aminocapronic acid)或氨甲環(huán)酸(tranexamin acid)結(jié)合在K5鏈回環(huán)的賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)，使Glu-Plg成開(kāi)放性構(gòu)型，因此，賴氨酸類似物顯著地促進(jìn)Glu-Plg的活性化，但與此相對(duì)，賴氨酸類似物阻礙了纖溶反應(yīng)（纖維蛋白的分解），這是由于介于纖溶酶原鏈回環(huán)上的賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)的Glu-Plg-纖維蛋白復(fù)合物的形成被阻抑了。在纖維蛋白溶解反應(yīng)的局域性和纖溶反應(yīng)的高效性上，血液中的Glu-Plg與纖維蛋白的結(jié)合以及由此帶來(lái)的空間結(jié)構(gòu)的變化發(fā)揮著重要的作用。纖溶酶原是由791個(gè)氨基酸構(gòu)成的單鏈糖蛋白，構(gòu)成糖約占分子量的2%。從N末端開(kāi)始順次分為N末端短肽結(jié)構(gòu)域（N-terminal peptide,NTP)、5個(gè)鏈回環(huán)結(jié)構(gòu)域（kringle 1,kringle 2,kringle 3,kringle 4,kringle 5)、酶活性中心結(jié)構(gòu)域和C末端氨基酸。酶活性中心在His603-Asp645-Ser740,uPA或tPA限定分解Arg561-Val562肽鍵（圖中的虛心箭頭位置）成雙鏈的纖溶酶，PA（plasminogen activator)切斷Arg561-Val562肽鍵后，N端的A鏈（或重鏈）C端的B鏈（或輕鏈）。
圖中圓圈和其中的字母表示具體的氨基酸及其位置：數(shù)字表示從N末端起始的氨基酸序列：實(shí)心箭頭表示彈性蛋白酶（elastase）、胃蛋白酶（pepsin)、鮮黃蛋白酶V8(aureus V8 protease)的水解位點(diǎn)，共6個(gè)；虛心箭頭表示纖溶酶原激活劑的作用位點(diǎn)；短橫線表示分子內(nèi)二硫鍵，共23個(gè)；短折線表示糖鏈；實(shí)心圓圈和其中的字母表示活性中心氨基酸及其位置。
Glu-Plg由NTP、5個(gè)鏈回環(huán)結(jié)構(gòu)域（K1～K5）、絲氨酸蛋白酶活性中心結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，在K1、K2、K4、K5存在賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)，K5的賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)由于也能識(shí)別氨基已糖，所以又稱作氨基已糖結(jié)合位點(diǎn)，能結(jié)合肽鏈中的賴氨酸。Glu-Plg分子的NTP Lys50(或Lys62)在K5的AH位點(diǎn)上形成分子內(nèi)結(jié)合鏈，維持著緊密的空間結(jié)構(gòu)，對(duì)活化作用顯示出抵抗性。通過(guò)K5與纖維蛋白或細(xì)胞受體的結(jié)合，以及纖溶酶切斷NTP，都會(huì)使纖溶酶原的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生馳豫，從而感受到PA的活性化。
2 促進(jìn)纖溶作用的化合物
到目前為止，主要的纖溶促進(jìn)化合物（圖3）的特性被歸納在表1，這些化合物的探索途徑、分離純化和纖溶促進(jìn)機(jī)制分述如下。 圖3 促進(jìn)纖溶作用的低分子天然化合物 表1 具有纖溶促進(jìn)作用化合物的特性注：-沒(méi)有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；*含有不同于纖溶酶原作用特點(diǎn)的特征
2.1 complestatin和chloropeptin 1 以纖溶酶原和纖溶酶原受體構(gòu)成in vitro檢索體系，用于探索促進(jìn)纖溶酶原向受體結(jié)合的低分子天然化合物。認(rèn)為促進(jìn)纖溶酶原向纖溶酶原受體結(jié)合的化合物也會(huì)促進(jìn)纖溶酶原和纖維蛋白（血栓）的結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)血栓的溶解。以U937細(xì)胞作為纖溶酶原受體的供體，使用人纖溶酶原構(gòu)成了纖溶促進(jìn)化合物的檢索體系，在對(duì)約5000株微生物的代謝產(chǎn)物進(jìn)行篩選的基礎(chǔ)上，從鏈霉菌屬（Streptomyces)的一株代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了低分子化合物圖3）complestatin和chloropeptin 1［7,8］促進(jìn)了纖溶酶原向U937纖溶酶原受體的結(jié)合。該化合物是從土壤的分離菌株中分離純化的，將活化培養(yǎng)的種子液接種到由可溶性淀粉3%、肉膏1%、混合溶液1.5%、玉米浸出汁2%和消泡劑CB442 0.01%構(gòu)成的液體培養(yǎng)基（pH7.0）中，在25℃、310 rpm的條件下連續(xù)培養(yǎng)3天，收獲的菌絲用70%丙酮溶液提取，提取物用乙酸乙酯萃取，萃取物經(jīng)丙酮-甲醇（5：1）硅膠層析后，活性化合物被移動(dòng)相為含0.2%三氟醋酸的45%乙氰水溶液的高壓液相色譜柱（Inertsil PREP-ODS)所精制。
chloropeptin 1是complestatin (c61H45N7O15Cl6,MW1325)的異構(gòu)體，只在苯甘氨酸-色氨酸殘基的結(jié)合位置不同。complestatin和chloropeptin 1在0.5～10μM的添加濃度下，使Glu-Plg向U937細(xì)胞的結(jié)合增加了2～5倍，這些化合物由于也增加了Glu-Plg和纖維蛋白的結(jié)合，所以可以認(rèn)為這些化合物是作用于纖溶酶原的，另外，這些化合物的作用能被ε-氨基已酸所阻礙，并且從化合物的作用特點(diǎn)能認(rèn)為纖溶酶原和U937細(xì)胞沒(méi)有形成新的結(jié)合方式，是complestatin和chloropeptin 1促進(jìn)了纖溶酶原和U937細(xì)胞介于賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的增加。伴隨著纖溶酶原向細(xì)胞或纖維蛋白結(jié)合的增加，細(xì)胞或纖維蛋白上纖溶酶的生成也增加了。在使用全血形成血栓的纖溶實(shí)驗(yàn)上，確認(rèn)了兩種化合物介于tPA促進(jìn)了血栓的溶解［8］，這之后，又確認(rèn)了這些化合物帶來(lái)了Glu-Plg空間結(jié)構(gòu)的變化以及促進(jìn)了介于uPA的Glu-Plg的活性化，從Glu-Plg空間結(jié)構(gòu)的變化也能說(shuō)明Glu-Plg向U937細(xì)胞結(jié)合的增加。另外，這些化合物不能直接促進(jìn)纖溶酶以及纖溶酶原激活劑的酰胺分解活性。
2.2 萜類化合物（staplabin,SMTPs: Stachybotrys Microspora Triprenyl Phenol) 在探索Glu-Plg和纖維蛋白結(jié)合的促進(jìn)化合物上，利用纖溶酶原-尿激酶前體-S2251的in vitro篩選體系，從微生物的培養(yǎng)液發(fā)現(xiàn)了新型的萜類代謝產(chǎn)物［9］，這之后，又發(fā)現(xiàn)了8種新型同類化合物［10～12］。Staplabin（圖3）具有顯著的促進(jìn)纖溶作用，該化合物分離于土壤微生物Stachybotrys Microspora的一個(gè)菌株。將經(jīng)過(guò)種子培養(yǎng)的菌株接種到1L培養(yǎng)液含30g葡萄糖、10g脫脂豆粉、3g肉膏、3g酵母粉、3g蛋白粉、0.5g磷酸二氫鉀、0.5g七水硫酸鎂和0.1g消泡劑CB442的培養(yǎng)基中，在25℃、180rpm用500ml三角瓶連續(xù)培養(yǎng)3～5天，培養(yǎng)液離心后，上清液用等量的2-丁酸抽提，抽提物用二氯甲烷和甲醇展開(kāi)于硅膠層析柱，活性成分被Inertsil SIL-ODS精制，移動(dòng)相是流速為9.9ml/min的乙烷和乙醇（98：2）的混合溶液。
300～500μM的staplabin使Glu-Plg和Lys-Plg與纖維蛋白的結(jié)合增加了，這種增加依賴于Glu-Plg和Lys-Plg上的賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)，并且在纖溶酶原激活劑存在下，Glu-Plg和Lys-Plg的活化被促進(jìn)了，所以體現(xiàn)出提高了纖溶酶的分解活性［13］，在使用分子排除層析的實(shí)驗(yàn)上由于該化合物部分地縮短了Glu-Plg和Lys-Plg的溶出時(shí)間，所以被認(rèn)為該化合物使這些分子馳豫。纖溶酶原活性化的促進(jìn)作用在ε-氨基已酸（epsilon-aminocapronic acid)和纖溶酶原斷片存在的情況下也能觀察到，所以能認(rèn)為staplabin帶來(lái)的構(gòu)型的變化和complestatin這些化合物帶來(lái)的變化是不同的［13］，這種結(jié)果，也被staplabin的活性化促進(jìn)作用能在mini-Plg上觀察到的事實(shí)所支持。SMTPs Stachybotrys Microspora Triprenyl Phenol）（圖3）也顯示出同樣的作用，但是SMTP-6、SMTP-7、SMTP-8與staplabin相比活性增加了3～10倍。
2.3 環(huán)肽化合物 在血漿存在下，利用U937細(xì)胞，探索促進(jìn)125I-纖維蛋白分解的促進(jìn)物質(zhì)時(shí)，發(fā)現(xiàn)了4種新型物質(zhì)plactins［14］（圖3）。
在和50種合成誘導(dǎo)物比較之后，發(fā)現(xiàn)plactins的D-Arg(或D-Lys)殘基和4個(gè)疏水殘基的立體配置構(gòu)型是顯示活性所必需的結(jié)構(gòu)［15］。20～50μM的plactin介于血漿中的因子將細(xì)胞表面的單鏈的尿激酶前體轉(zhuǎn)變成活化型的雙鏈結(jié)構(gòu)，而開(kāi)始了纖溶反應(yīng)。該活化機(jī)制比較復(fù)雜，介于多個(gè)因子的多條途徑引起了促進(jìn)纖溶作用。將Plactin 2.5～5mg/kg投于肺栓塞小鼠，小鼠栓塞肺的纖溶活性被促進(jìn)了2～3倍。在uPA存在下，40～60μM的plactin使Glu-Plg的活化被提高了10倍，并且plactins使Glu-Plg的內(nèi)部熒光增加了5%，但plactins對(duì)Lys-Plg的活性沒(méi)有影響。與前述的化合物不同，plactin沒(méi)有增加Glu-Plg與纖維蛋白的結(jié)合。該化合物在血漿/U937細(xì)胞體系將纖維蛋白的分解提高了3～4倍，但在Glu-Plg/U937細(xì)胞體系和Glu-Plg/uPA體系，沒(méi)有促進(jìn)纖維蛋白的分解，這暗示著plactin的促進(jìn)纖溶作用依賴于Glu-Plg以外的通路。
2.4 脂蛋白（surfactin) 在尿激酶前體和纖溶酶原構(gòu)成的反應(yīng)體系中，尿激酶前體的內(nèi)因性活性作用帶來(lái)了Glu-Plg的活化，從纖溶酶原轉(zhuǎn)化生成的纖溶酶將進(jìn)一步把尿激酶前體轉(zhuǎn)變成具有充分活性的尿激酶，利用該正反饋體系，從細(xì)菌的代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)了尿激酶前體-纖溶酶原反應(yīng)體系中促進(jìn)纖溶作用的物質(zhì)surfactin類化合物，該類化合物是一種脂蛋白［16］（圖3）。
從土壤分離到的一株枯草芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物被檢索出來(lái)具有促進(jìn)纖溶作用，將該菌株用普通細(xì)菌培養(yǎng)基在28℃、180rpm連續(xù)培養(yǎng)5天后，將培養(yǎng)液用2-丁醇提取后，提取物用乙氰-0.1%乙酸（60：40）展開(kāi)于高壓液相色譜柱Inertsil PREP-ODS上，活性成分經(jīng)濃縮和凍結(jié)干燥后得到了脂蛋白surfactin。
3～10μM的surfactin C使纖溶酶原和尿激酶前體的轉(zhuǎn)換被提高了3～4倍，這種促進(jìn)作用是由于surfactin C促進(jìn)了尿激酶引起的Glu-Plg的活化。Surfactin C也促進(jìn)了Lys-Plg的活化，但surfactin C不影響mini-Plg的活化，在ε-氨基乙酸存在下也不影響Glu-Plg的活化，這個(gè)結(jié)果暗示著surfactin C作用于纖溶酶原鏈回環(huán)的K1、K2、K3、K4中的某個(gè)或某幾個(gè)結(jié)構(gòu)域，因?yàn)棣?氨基已酸作用于纖溶酶原鏈回環(huán)的K5結(jié)構(gòu)域，而不影響纖溶酶原鏈回環(huán)的K1、K2、K3、K4結(jié)構(gòu)域。surfactin C使Glu-Plg的內(nèi)部熒光增加了7.4%，有分子排除層析實(shí)驗(yàn)上使Glu-Plg的溶出時(shí)間縮短，從這些結(jié)果上能判斷Glu-Plg的空間結(jié)構(gòu)被馳豫了。該化合物促進(jìn)了Glu-Plg和纖維蛋白的結(jié)合，在pro-uPA/Glu-Plg,uPA/Glu-Plg,uPA/血漿體系促進(jìn)了纖溶作用。該化合物（1mg/kg)和pro-uPA投于肺栓塞大白鼠，125I標(biāo)記的大白鼠肺栓塞的溶解速度與對(duì)照相比被提高了3倍。
2.5 脂類化合物 利用纖溶酶原和尿激酶前體的相互活化作用，探討了具有促進(jìn)纖溶作用的天然化合物，對(duì)700多種植物提取液進(jìn)行篩選的結(jié)果，從海藻中發(fā)現(xiàn)了一種稀有化合物α-D-葡萄糖甘油二酯［17］（圖3）的促進(jìn)纖溶作用。將干燥的褐藻添加到三氯甲烷和甲醇的混合有機(jī)溶劑（HCCl3：CH3OH=2：1）中，用組織搗碎機(jī)充分破碎，過(guò)濾之后回收濾液，針對(duì)殘?jiān)貜?fù)一次上述的提取過(guò)程，再用提高了溶劑極性的混合液（HCCl3：CH3OH=1：2）提取殘?jiān)械目扇苄晕镔|(zhì)。把三次提取的濾液混合，經(jīng)減壓濃縮和真空干燥，從褐藻中得到了粗提取物，該粗提物經(jīng)3次柱層析后得到了精制的生物活性物質(zhì)α-D-葡萄糖甘油二酯。
相當(dāng)?shù)蜐舛鹊钠咸烟歉视投ィ?.66μM)促進(jìn)了纖溶酶原和尿激酶前體的相互活化作用，而半乳糖甘油二酯在20倍于α-D-葡萄糖甘油二酯的濃度下，仍然不能促進(jìn)這種纖溶酶原和尿激酶前體的相互活化作用。從這兩種結(jié)構(gòu)相似的中性甘油糖脂質(zhì)的不同作用上，能夠推測(cè)α-D-葡萄糖甘油二酯的促進(jìn)纖溶作用不是這一類化合物的共同特性。在高濃度的絲氨酸蛋白酶抑制劑存在、纖溶酶原和尿激酶前體相互活化、尿激酶前體不發(fā)生活性化開(kāi)裂的反應(yīng)體系中，α-D-葡萄糖甘油二酯促進(jìn)了纖溶酶原的活性化開(kāi)裂，由此說(shuō)明α-D-葡萄糖甘油二酯作用于該體系中的尿激酶前體，提高了尿激酶前體的內(nèi)因性尿激酶型纖溶酶原激活劑的作用。與此相一致，纖溶酶原/尿激酶前體相互活化反應(yīng)體系的另外兩個(gè)反應(yīng)，既纖溶酶引起的尿激酶前體的活化反應(yīng)和尿激酶型纖溶酶原激活劑引起的纖溶酶原的活化反應(yīng)，α-D-葡萄糖甘油二酯對(duì)這兩個(gè)反應(yīng)的影響是相當(dāng)小的。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖甘油二酯帶來(lái)了尿激酶前體內(nèi)部熒光的有意義增加以及它不影響纖溶酶原和尿激酶型纖溶酶原活化因子的內(nèi)部熒光的變化。由這個(gè)結(jié)果能夠推測(cè)葡萄糖甘油二酯帶來(lái)了尿激酶前體空間結(jié)構(gòu)的變化，并且能認(rèn)為尿激酶前體的這個(gè)空間結(jié)構(gòu)的變化與尿激酶前體的內(nèi)因性纖溶酶原激活劑的作用有關(guān)。首次發(fā)現(xiàn)了提高尿激酶前體的內(nèi)因性活性的天然生理活性化合物。
3 討論
到目前為止，作為酶抑制劑的天然化合物是合成化合物已經(jīng)知道的很多，但與此相對(duì)，如果除去輔酶、金屬鹽類和酶原保護(hù)劑等物質(zhì)，作為酶活化劑的物質(zhì)的數(shù)量是相當(dāng)少的。上述所敘述的化合物不是作用于酶而是作用于酶的前體-酶原，這些化合物所以能夠被確定為具有活性作用，得益于纖溶酶原分子的獨(dú)特結(jié)構(gòu)。當(dāng)機(jī)體受到內(nèi)在或外在的刺激，凝固-纖溶系統(tǒng)迅速對(duì)應(yīng)的必要性被通過(guò)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的變化（與酶的活化有關(guān)）體現(xiàn)出來(lái)，這被認(rèn)為是機(jī)體進(jìn)化的一個(gè)方面。纖溶酶原是這種變化過(guò)程的一個(gè)典型，發(fā)現(xiàn)的這些具有促進(jìn)纖溶作用的化合物使纖溶酶原的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生微妙的變化從而促進(jìn)了纖溶作用。從以上的這些事實(shí)還能夠進(jìn)一步推測(cè)纖溶因子如纖溶酶、尿激酶、尿激酶前體的活性化合物也會(huì)促進(jìn)血栓纖維蛋白的溶解，并且纖溶系統(tǒng)抑制因子的抑制化合物也會(huì)促進(jìn)血栓纖維蛋白的溶解。
溶血鏈球菌產(chǎn)生的鏈激酶等細(xì)菌的代謝產(chǎn)物和纖溶系統(tǒng)的關(guān)系從很早以前就知道了，最近又從侵染性的多種病原菌中發(fā)現(xiàn)了纖溶酶原的受體［2］，這些受體被認(rèn)為與病原性細(xì)菌的侵入和組織侵入有關(guān)。與這些受體蛋白質(zhì)相比較，上述敘述的化合物是低分子化合物，這些低分子化合物來(lái)自于細(xì)菌、放線菌、霉菌和海洋生物，作用于纖溶酶原或是尿激酶前體。產(chǎn)生這些化合物的生產(chǎn)菌和高等動(dòng)物的關(guān)系如何？雖然目前的材料還不充分，但這些化合物的存在也讓研究者能進(jìn)一步探索這些化合物在病原菌侵染、組織纖溶、癌細(xì)胞游走和血栓疾病治療上的巨大價(jià)值。
被應(yīng)用于纖溶療法上的酶或高分子蛋白如尿激酶、tPA等，主要是應(yīng)用于心肌梗塞等重度血栓疾患的治療上，它會(huì)帶來(lái)全身出血的重大危險(xiǎn)性，與此相對(duì)應(yīng)，作用于纖溶酶原和尿激酶前體的低分子化合物會(huì)使生理的纖溶反應(yīng)平穩(wěn)的進(jìn)行，特別適用于慢性疾患的治療以及血栓疾病的前期，這些化合物正被人們期待著能成為安全、高效的血栓治療藥物。
摘要：本文結(jié)合堆肥化、衛(wèi)生填埋兩種現(xiàn)行的城市生活垃圾處理工藝，主要介紹了城市生活垃圾生物處理過(guò)程中的微生物種群，以及通過(guò)分析開(kāi)發(fā)出的新的微生物技術(shù)，指出了應(yīng)用于城市生活垃圾處理的高效的微生物技術(shù)的研究方向。
關(guān)鍵詞：城市生活垃圾 微生物 強(qiáng)化微生物處理技術(shù) 基因工程
隨著城市化進(jìn)程在全球范圍的加速，城市化帶來(lái)的環(huán)境污染和人類聚居狀況惡化等問(wèn)題，已成為世界各國(guó)共同關(guān)心的問(wèn)題。城市生活垃圾（Municipal solid waste, 簡(jiǎn)稱MSW）是在城市日常生活及為城市生活提供服務(wù)的活動(dòng)中產(chǎn)生的固體廢棄物，是城市環(huán)境的主要污染物之一。目前，城市生活垃圾處理處置的方法主要包括衛(wèi)生填埋（Sanitary landfill）、堆肥化(Composting)、焚燒(Incineration)三種，其中前兩種處理方式均屬于生物處理技術(shù)。具體來(lái)說(shuō)，MSW生物處理技術(shù)就是城市生活垃圾中固有的或外添加的微生物，在一定控制條件下，進(jìn)行一系列的生物化學(xué)反應(yīng)，使得MSW中的不穩(wěn)定的有機(jī)物代謝后釋放能量或轉(zhuǎn)化為新的細(xì)胞物質(zhì)，從而MSW逐步達(dá)穩(wěn)定化的一個(gè)生化過(guò)程。
1. 城市生活垃圾生物處理中主要的微生物
MSW生物處理技術(shù)主要包括好氧和厭氧生物處理。好氧生物處理如：好氧堆肥、生物反應(yīng)器填埋等，其工藝中的微生物主要有細(xì)菌、放線菌、真菌等微生物種群。厭氧生物處理，如：厭氧消化、厭氧填埋等，其工藝中的微生物又稱“瘤胃微生物”，主要有水解細(xì)菌、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌群和產(chǎn)甲烷菌群等。
1.1 城市生活垃圾好氧生物處理中的微生物
1.1.1 細(xì)菌
在MSW好氧生物降解過(guò)程中，細(xì)菌憑借強(qiáng)大的比表面積，可以快速將可溶性底物吸收到細(xì)胞中，進(jìn)行胞內(nèi)代謝?？偟膩?lái)說(shuō)，其數(shù)量要比放線菌和真菌多得多。當(dāng)然，在不同的環(huán)境中分離的細(xì)菌在分類學(xué)上具有多樣性，主要有假單胞菌屬（pseudomonas）、克雷伯氏菌屬（klebsiella）以及芽孢桿菌屬（bacillus）的細(xì)菌[1]。在堆肥過(guò)程中，細(xì)菌總數(shù)的變化趨勢(shì)是高-低-高。堆肥初期，有機(jī)廢物中攜帶有的大量細(xì)菌分解有機(jī)物質(zhì)釋放能量，使堆體溫度上升，此時(shí)，常溫細(xì)菌受到抑制，嗜溫細(xì)菌活躍；當(dāng)堆溫升至高溫階段，只有少量的嗜熱細(xì)菌可以活動(dòng)；高溫期過(guò)后，隨著有機(jī)成分的減少，堆體溫度降低，嗜溫及常溫細(xì)菌又開(kāi)始活躍，使細(xì)菌總數(shù)上升。整個(gè)好氧降解過(guò)程中，嗜溫細(xì)菌是堆肥系統(tǒng)中最主要的微生物。
1.1.2 放線菌
放線菌具有多細(xì)胞菌絲，可以分解一些纖維素,并溶解木質(zhì)素。它比真菌能夠忍受更高的溫度和pH值,在垃圾生物降解的高溫階段是分解木質(zhì)纖維素的優(yōu)勢(shì)菌群。研究表明，諾卡氏菌（nocardia）、鏈霉菌（streptomyces）、高溫放線菌（thermoactinomyces）和單孢子菌（micromonospora）等在MSW好氧堆肥中占優(yōu)勢(shì)[1]。
1.1.3 真菌
在MSW生物降解過(guò)程中，真菌對(duì)垃圾有機(jī)成分的分解和穩(wěn)定化起著重要的作用。真菌不僅能分泌胞外酶，水解有機(jī)物質(zhì)，而且由于其菌絲的機(jī)械穿插作用，還對(duì)物料起一定的物理破壞作用，促進(jìn)生化反應(yīng)。溫度是影響真菌生長(zhǎng)的重要因素之一，堆肥過(guò)程中隨著溫度的升高,真菌的菌落數(shù)開(kāi)始減少,在64℃左右,嗜熱性真菌幾乎全部消失。當(dāng)溫度下降到60℃以下時(shí),嗜溫性真菌和嗜熱性真菌又都會(huì)重新出現(xiàn)在堆肥中[2]。
1.2 厭氧生物處理微生物
MSW的厭氧生物處理依次分為水解、產(chǎn)氫產(chǎn)酸和產(chǎn)甲烷三個(gè)階段，每個(gè)階段各有其獨(dú)特的微生物類群起生物降解作用。
1.2.1 水解細(xì)菌
水解階段水解細(xì)菌利用胞外酶對(duì)有機(jī)物進(jìn)行體外酶解，使固體物質(zhì)變成可溶于水的物質(zhì)，然后細(xì)胞將其吸收，水解成不同產(chǎn)物，該階段起作用的細(xì)菌為水解細(xì)菌。Hungate分離出了以下幾種水解菌：（1）產(chǎn)琥珀酸擬桿菌屬,（2）湖生(lochheadii)芽孢菌屬,（3）柱孢梭菌屬,（4）生黃瘤胃球菌,（5）白色瘤胃球菌落,（6）溶纖維丁酸弧菌。同時(shí)還分離出纖維酶B—1,4—葡聚糖酶,外B—1,4—葡聚糖酶和纖維素二糖酶[3]。
1.2.2 產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌群
產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌群是將第一階段發(fā)酵產(chǎn)物如丙酸等三碳以上有機(jī)酸、長(zhǎng)鏈脂肪酸和醇類等氧化分解成乙酸和分子氫。在衛(wèi)生填埋場(chǎng)中已分離出產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌布氏甲烷桿菌屬和G株布氏甲烷桿菌屬等[3]。
1.2.3 產(chǎn)甲烷菌群
甲烷菌利用H2/CO2、醋酸和甲醇甲酸等C類化合物為基質(zhì)，將其轉(zhuǎn)化為甲烷。在衛(wèi)生填埋場(chǎng)中,產(chǎn)甲烷菌群分桿狀菌、球狀菌和八疊球菌三類。桿狀產(chǎn)甲烷菌通常呈彎曲、鏈狀或絲狀,此類細(xì)菌有史密斯甲烷短桿菌屬、甲酸甲烷桿菌屬、巴氏甲烷桿菌屬、反芻甲烷短桿菌屬、史密斯甲烷桿菌屬、嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌等；球狀產(chǎn)甲烷細(xì)菌直徑為0.3～5微米,球形細(xì)胞呈正圓形或橢圓形,成對(duì)排列成鏈狀。此類細(xì)菌有巴氏甲烷八疊球菌、范尼氏甲烷球菌、沃氏甲烷球菌、馬氏產(chǎn)甲烷球菌、海生產(chǎn)甲烷球菌及嗜熱無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)甲烷球菌等。八疊球狀產(chǎn)甲烷菌,其細(xì)胞繁殖成規(guī)則、大小一致的類似砂粒的堆積物,有227巴氏甲烷八疊球菌、巴氏甲烷八疊球菌、嗜熱甲烷八疊球菌等[3]。
2. 微生物技術(shù)在MSW處理過(guò)程中的應(yīng)用
MSW的生物處理主要是利用微生物在一定控制條件下，使有機(jī)物發(fā)生生物化學(xué)降解，形成一種穩(wěn)定的化合物的過(guò)程。因此，微生物對(duì)垃圾中有機(jī)物降解的快慢、對(duì)有機(jī)成分降解的程度直接決定著處理周期的長(zhǎng)短和處理效果的好壞，在MSW處理過(guò)程中起著決定性的作用。故MSW生物處理的優(yōu)劣取決于微生物自身的結(jié)構(gòu)、所處環(huán)境下的代謝狀況。目前有很多學(xué)者在此方面做出了很大的努力，通過(guò)分析某種處理環(huán)境下微生物的特性、采用多種方式改變工藝中微生物的數(shù)量，質(zhì)量等，開(kāi)發(fā)出了多種MSW生物處理技術(shù)，如：強(qiáng)化微生物（純種分離、強(qiáng)化接種、添加微生物菌劑、微生物固定化）以及基因誘變等技術(shù)。
2.1 強(qiáng)化微生物處理技術(shù)
強(qiáng)化微生物處理技術(shù)是從改變工藝中單位反應(yīng)器空間內(nèi)微生物的質(zhì)量或數(shù)量的角度來(lái)增強(qiáng)MSW的降解率，從而提高處理效率，縮短處理周期。
2.1.1 純種分離
自然界中的微生物總是雜居在一起，即使一粒土或一滴水中也生存著多種微生物。為了提高工藝中某種有效微生物的質(zhì)量（純度），提高處理效率，必須進(jìn)行微生物的純種分離技術(shù)。常見(jiàn)的純種微生物的分離方法有平板劃線分離、液體稀釋法分離、利用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行分離以及菌絲尖端切割分離[4]。
（1） 平板劃線分離
將已經(jīng)熔化的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中制成平板，用接種環(huán)沾取少量待分離的材料，在培養(yǎng)基表面平行或分區(qū)劃線(圖1)，然后，將培養(yǎng)皿放入恒溫箱里培養(yǎng)。在線的開(kāi)始部分，微生物往往連在一起生長(zhǎng)，隨著線的延伸，菌數(shù)逐漸減少，最后可能形成純種的單個(gè)菌落。
圖1 幾種劃線方法示意圖
（2） 液體稀釋法
將待分離的樣品經(jīng)過(guò)大量稀釋后，取稀釋液均勻地涂布在培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)后就可能得到單個(gè)菌落。
（3） 利用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行分離
不同的微生物對(duì)不同的試劑、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用這些特點(diǎn)可配制出適合某種微生物生長(zhǎng)而限制其他微生物生長(zhǎng)的選擇培養(yǎng)基。用這種培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)微生物就可以達(dá)到純種分離的目的。
（4） 菌絲尖端切割
這種方法適于絲狀真菌。用無(wú)菌的解剖刀切取位于菌落邊緣的菌絲的尖端，將它們移到合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，就能得到新菌落。
2.1.2 強(qiáng)化接種處理技術(shù)
純種分離后還要將微生物接種到垃圾中進(jìn)行生物處理，但由于接種微生物的生存環(huán)境發(fā)生了變化，故在微生物適應(yīng)周圍環(huán)境前，處理效率達(dá)不到理想的效果，因而直接在垃圾中進(jìn)行微生物接種的處理效果則應(yīng)好于微生物純種分離后再接種的處理效果。直接在垃圾中進(jìn)行微生物接種可采用多種方式，如：垃圾滲濾液循環(huán)、加入一定比例的垃圾腐熟物等。
微生物對(duì)垃圾的降解是在多種微生物的協(xié)同作用下完成，在適宜的條件下，微生物協(xié)同作用能力的大小取決于微生物種群的大小與結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。一般說(shuō)來(lái)，生物的種群越大，其自動(dòng)調(diào)控能力越好，適應(yīng)性就越強(qiáng)，結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。經(jīng)垃圾滲濾液循環(huán)或向待處理的新鮮垃圾中加入一定比例的垃圾腐熟物進(jìn)行強(qiáng)化接種培養(yǎng)后，微生物的種群擴(kuò)大，且循環(huán)次數(shù)越多，微生物的數(shù)量和種群就越大，這樣就會(huì)更有利于對(duì)垃圾的降解。
2.1.3 添加微生物菌劑
研究表明,單一的細(xì)菌、真菌、放線菌群體,無(wú)論其活性多高,在加快垃圾生物降解進(jìn)程中的作用都比不上復(fù)合微生物菌群的共同作用[5]。微生物菌劑是采用分離、篩選的有效微生物，配合一定的處理工藝和設(shè)備，通過(guò)合理地調(diào)配各種有效微生物的含量，進(jìn)行篩選、培育MSW生物處理的高效復(fù)合微生物菌劑，進(jìn)而來(lái)調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)、提高微生物降解活性，提高微生物降解有機(jī)成分的效率。復(fù)合微生物菌群中既有分解性細(xì)菌，又有合成性細(xì)菌；既有纖維素分解菌、真菌，又有放線菌。向工藝中添加復(fù)合微生物菌劑，不僅增加了工藝中微生物初始濃度，而且改善了工藝中微生物的種群結(jié)構(gòu)。作為多種細(xì)菌共存的一種生物群落，依靠相互間共生增殖及協(xié)同作用，代謝出抗氧化物質(zhì)，生成穩(wěn)定而復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，使得整個(gè)生物降解過(guò)程中微生物數(shù)量保持相對(duì)穩(wěn)定，處理效果較佳[6]。
2.1.4 固定化技術(shù)
固定化微生物技術(shù)是將微生物固定在載體上，使其高密度密集并保持其生物功能，在適宜的條件下還可增殖，以滿足處理工藝的要求[7]；實(shí)質(zhì)上是從增加單位反應(yīng)器內(nèi)微生物數(shù)量的角度來(lái)提高微生物的活性，使得細(xì)胞密度高，微生物流失少、不需分離，就能純化和保存高效菌株等優(yōu)勢(shì)，反應(yīng)速度快，運(yùn)行穩(wěn)定、可靠，從而節(jié)約運(yùn)行成本，提高M(jìn)SW的處理效率。固定化微生物技術(shù)目前國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有一個(gè)統(tǒng)一的分類標(biāo)準(zhǔn)，方法也多種多樣，主要有載體結(jié)合固定化（吸附法）、交聯(lián)固定化、包埋固定化和共價(jià)結(jié)合法，各種固定化方法和載體都各有特點(diǎn),見(jiàn)表1。其中，微生物細(xì)胞的固定化方法以包埋法和吸附法最為常用。包埋法是將微生物封閉在天然高分子多糖類或合成高分子凝膠的網(wǎng)絡(luò)中，從而使微生物固定化；其特點(diǎn)是可以將固定化微生物制成各種形狀(球狀、塊狀、圓柱狀、膜狀、布狀、管狀等)，但包埋法制得的固定化微生物對(duì)傳質(zhì)有一定的影響。吸附法是將微生物細(xì)胞附著于固體載體上，微生物細(xì)胞與載體之間不起化學(xué)反應(yīng)，并且具有操作簡(jiǎn)單、固定化條件溫和、細(xì)胞活性損失小、載體可以反復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，所以被廣泛應(yīng)用和深入研究[8]。
論文關(guān)鍵詞 土壤宏基因組學(xué)；研究進(jìn)展；局限性
論文摘要 土壤宏基因組學(xué)技術(shù)是近來(lái)發(fā)展比較迅速的一種新方法，是研究土壤微生物生態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)，也是獲是土壤中各種基因資源的一種有效手段。介紹了土壤宏基因文庫(kù)的構(gòu)建、篩選及土壤宏基因組研究現(xiàn)狀和這一技術(shù)的局限性。
宏基因組學(xué)源于20世紀(jì)70年代土壤微生物基因組DNA的直接提取技術(shù)的實(shí)現(xiàn)，隨著微生物學(xué)和生物技術(shù)的不斷發(fā)展，Handelsman于1998年提出了宏基因組學(xué)的概念[1]。宏基因組學(xué)又叫環(huán)境基因組學(xué)（Environmental Genomics）或群體基因組學(xué)（Community Genomics），定義為利用現(xiàn)代基因組技術(shù)直接研究自然狀態(tài)環(huán)境中的有機(jī)體群落，而不需要分離、培養(yǎng)單一種類的微生物。生物學(xué)和化學(xué)的結(jié)合孕育了宏基因組學(xué)的誕生，而宏基因組學(xué)的發(fā)展需要最大限度的利用現(xiàn)代生物技術(shù)和實(shí)用篩選技術(shù)。
土壤宏基因組學(xué)技術(shù)是近來(lái)發(fā)展比較迅速的一種新方法[2]，這種方法從土壤環(huán)境樣品中直接提取微生物基因組DNA（宏基因組）并克隆于不同載體，再將重組載體轉(zhuǎn)移到適宜的宿主以建立宏基因組文庫(kù)；同時(shí)結(jié)合不同的篩選技術(shù)，從基因文庫(kù)中篩選新基因或新的生物活性物質(zhì)。應(yīng)用這些免培養(yǎng)的新方法和新技術(shù)，可以繞過(guò)微生物菌種分離培養(yǎng)這一技術(shù)難關(guān)，直接在基因水平上研究、開(kāi)發(fā)和利用無(wú)法培養(yǎng)的微生物資源；有利于揭示不可培養(yǎng)微生物的基因多樣性，為農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展提供豐富的資源。
1土壤宏基因文庫(kù)的構(gòu)建
關(guān)于土壤宏基因組學(xué)技術(shù)的構(gòu)建已有許多研究報(bào)道[3]，文庫(kù)的構(gòu)建需要足夠高質(zhì)量的DNA，由于土壤微生物往往會(huì)與土壤其他組分緊密結(jié)合，這就增加了提取土壤DNA的難度[4]。常用的方法包括直接提取法和間接提取法。直接提取法是將樣品直接懸浮在裂解緩沖液中處理，使其釋放DNA，繼而抽提純化；間接提取法是首先去除土壤等雜質(zhì)，通過(guò)不同的離心速度從土壤中分離出細(xì)胞，然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行抽提。直接提取法提取的DN段較?。?~50kb），提取率高，操作簡(jiǎn)單；間接提取法提取的片斷較大（20~500kb），純度高，但操作繁瑣，有些微生物在分離過(guò)程中會(huì)丟失。
根據(jù)插入片斷大小，可以把基因文庫(kù)分成2類：質(zhì)粒載體的小片段插入（小于15kb）和柯斯質(zhì)粒（15~40kb）或BAC（細(xì)菌人工染色體）（超過(guò)40kb）載體的大片段插入。大腸桿菌（Escherichia coli）是表達(dá)土壤細(xì)菌基因或基因簇的通用宿主，穿梭載體或BAC文庫(kù)可將大腸桿菌包含的文庫(kù)信息轉(zhuǎn)移至其他宿主如鏈霉菌或假單胞菌[5]。
載體系統(tǒng)的選擇取決于所提取土壤DNA的質(zhì)量及研究目的，包括欲插入目的片段的大小、所需要的載體拷貝數(shù)、使用的宿主以及篩選方法等。如對(duì)腐殖質(zhì)含量較高或剪切較嚴(yán)重的DNA樣品適宜構(gòu)建質(zhì)粒文庫(kù)，小片段的文庫(kù)適用于篩選新的與代謝相關(guān)的單基因或小操縱子；而對(duì)于含較大基因簇或大片段的DNA樣品則需要構(gòu)建大片段和大容量的載體文庫(kù)。Rondon直接把環(huán)境DNA克隆到低拷貝BAC載體，以大腸桿菌作為宿主構(gòu)建了含100Mbp 的小文庫(kù)（SL1），
并從這個(gè)文庫(kù)中檢測(cè)到DNA酶、脂肪酶、淀粉水解酶的活性。
2土壤宏基因組文庫(kù)的篩選
宏基因文庫(kù)的篩選主要有功能驅(qū)動(dòng)篩選、化合物結(jié)構(gòu)水平的篩選、序列驅(qū)動(dòng)篩選，底物誘導(dǎo)基因表達(dá)篩選。功能驅(qū)動(dòng)篩選是根據(jù)重組克隆產(chǎn)生的新活性進(jìn)行篩選，在工業(yè)上有很多重要的酶就是用這種方法發(fā)現(xiàn)的。其主要缺點(diǎn)是要在寄主中進(jìn)行功能表達(dá)，造成篩選工作量大，效率低?；衔锝Y(jié)構(gòu)水平的篩選是根據(jù)不同結(jié)構(gòu)的物質(zhì)在色譜中有不同的峰值，通過(guò)比較轉(zhuǎn)入和未轉(zhuǎn)入外源基因的宿主細(xì)胞或發(fā)酵液抽提物的色譜圖篩選產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)化合物的克隆子。此方法工作量大，費(fèi)用高。序列驅(qū)動(dòng)篩選是不依賴重組基因在宿主中表達(dá)來(lái)篩選，而是根據(jù)已知功能的基因序列設(shè)計(jì)探針或PCR引物，通過(guò)雜交進(jìn)行篩選具有目標(biāo)序列的克隆子。底物誘導(dǎo)基因表達(dá)篩選是利用底物誘導(dǎo)克隆子分解代謝基因進(jìn)行篩選，這種方法已經(jīng)成功的從宏基因中篩選出芳烴化合物誘導(dǎo)的基因。國(guó)內(nèi)外的資料顯示這4種篩選方法可以篩選到所需要的物質(zhì)，但篩選效率低，費(fèi)用高。
3土壤宏基因組研究現(xiàn)狀
利用宏基因組學(xué)的技術(shù)，科研人員篩選到了許多功能基因，加拿大TerraGen Discover公司最先在以鏈霉菌為宿主的宏基因組文庫(kù)中篩選到了具有抗菌活性的5種新的小分子物質(zhì)TerragineA、B、C、D、E[5]；Courtois等利用柯斯載體構(gòu)建了含5 000個(gè)克隆子的環(huán)境基因組文庫(kù)，采用PCR 序列分析的方法，篩選出編碼聚酮合成酶的新基因，同時(shí)采用HPLC技術(shù)發(fā)現(xiàn)了脂肪二烯醇中2種新的化合物，兩者互為同分異構(gòu)體；Yun等選用pUC19為克隆載體構(gòu)建大腸桿菌基因組文庫(kù)，利用活性篩選方法，從30 000個(gè)重組子中篩選出1個(gè)含淀粉酶基因（amyM）的克隆子。
2005年，LimHK等以枯草芽孢桿菌為宿主，建立了森林土壤的宏基因組文庫(kù)，篩選到2個(gè)具有抗菌活性的克隆，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，得出其中一個(gè)為產(chǎn)紅色色素的靛玉紅，另一個(gè)為產(chǎn)藍(lán)色色素的靛藍(lán)，是靛玉紅的異構(gòu)體。2006年，Voget S等首次研究了從土壤宏基因組文庫(kù)中篩選到的一種纖維素酶的性質(zhì)，證實(shí)了其具有較廣的pH值和溫度適應(yīng)范圍，并且在較高的鹽度時(shí)也具有活性，具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
4土壤宏基因組學(xué)的技術(shù)局限性
總DNA提取技術(shù)尚存在一定的限制，土壤環(huán)境中，由于微生物與土壤顆粒緊密結(jié)合的特性以及腐殖酸等抑制性物質(zhì)存在等原因，從中難以獲得適于構(gòu)建宏基因組文庫(kù)的高分子量DNA。Bertrand等采用間接提取法，通過(guò)Nycodenz梯度離心，所回收的土壤DN段大小己能達(dá)到400kbp，但至今基于原位裂解獲得>100kbp土壤DNA的提取技術(shù)尚未突破，運(yùn)用原位裂解法構(gòu)建更大片段環(huán)境宏基因組文庫(kù)（現(xiàn)有的土壤宏基因組文庫(kù)中，平均插人片段最大為44.5kb）仍是一個(gè)難點(diǎn)。不可避免地，環(huán)境宏基因組文庫(kù)所包含微生物基因組信息的偏差將直接導(dǎo)致“基因遺漏”現(xiàn)象發(fā)生，如海洋中普遍存在的微生物固氮基因，卻在測(cè)序量高達(dá)1.6Gbp的馬尾藻海水宏基因組文庫(kù)中被遺漏，表明僅運(yùn)用宏基因組學(xué)技術(shù)同樣會(huì)忽略部分的微生物資源。
陽(yáng)性克隆篩選頻率低是宏基因組學(xué)的另一個(gè)瓶頸所在，運(yùn)用經(jīng)典的功能篩選方式，往往是在數(shù)千個(gè)，甚至數(shù)百萬(wàn)個(gè)重組克隆子中才能檢測(cè)到有用的活性克隆，造成此局面一個(gè)重要的原因是外源基因的異源表達(dá)水平低下。目前根據(jù)核酸序列相似性及基因保守區(qū)設(shè)計(jì)探針或引物的雜交、PCR篩選方法，從文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)新基因的比率尚不到已知基因的40%。
環(huán)境微生物宏基因組研究能讓我們發(fā)現(xiàn)存在于不可培養(yǎng)微生物中的一些重要的生理過(guò)程。許多實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)開(kāi)始努力從不可培養(yǎng)土壤生物的基因組序列中去獲得重要的基因，特別是從Acidobacterium組中，因?yàn)樗峭寥乐凶畛Ｒ?jiàn)的細(xì)菌。這些數(shù)據(jù)提供了關(guān)于這些生物在土壤中扮演角色的線索。隨著足夠序列信息的獲得，這些生物的代謝途徑將被構(gòu)建出來(lái)，引導(dǎo)我們采取有效的策略去培養(yǎng)這些生物。這些數(shù)據(jù)也將準(zhǔn)許我們構(gòu)建包含所有已知開(kāi)放閱讀框的微生物芯片，來(lái)確定這些基因在時(shí)間和空間上的表達(dá)狀況。
盡管宏基因組技術(shù)本身還存在著一些局限性，但它為土壤微生物的研究提供了一種有效的研究策略，尤其是對(duì)于99％以上不能獲得純培養(yǎng)的土壤微生物來(lái)說(shuō)，宏基因組學(xué)不僅是研究土壤微生物生態(tài)學(xué)的堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，更是我們獲得土壤中各種基因資源的一個(gè)有效手段。
【摘要】 目的 建立硝酸咪康唑搽劑微生物限度檢查法。方法 測(cè)定硝酸咪康唑搽劑對(duì)大腸埃希菌等5種試驗(yàn)菌的回收率，對(duì)2個(gè)控制菌（銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌）的檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果 用薄膜過(guò)濾法和0.1%吐溫80-ph7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液作沖洗劑檢查本品的細(xì)菌總數(shù)、真菌及酵母菌計(jì)數(shù)，其試驗(yàn)菌回收率均達(dá)到70%以上。同樣用該方法檢查本品的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌，其試驗(yàn)組呈陽(yáng)性反應(yīng)，陰性菌對(duì)照組呈陰性反應(yīng)。結(jié)論 用薄膜過(guò)濾法聯(lián)用0.1%吐溫80-ph7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液作沖洗劑可以消除硝酸咪康唑搽劑在試驗(yàn)條件下的抑菌作用，從而順利檢出該品種所污染的各種微生物。
【關(guān)鍵詞】 硝酸咪康唑搽劑；微生物限度檢查；方法學(xué)驗(yàn)證
微生物限度檢查法是檢查非規(guī)定制劑及原料、輔料受微生物污染程度的方法，檢查項(xiàng)目包括細(xì)菌數(shù)、真菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查［1］。但具有抑菌成分的藥品由于其抑菌活性的干擾，常規(guī)檢查結(jié)果不能真實(shí)地反映出藥品中污染微生物的情況，必須先消除供試品中的抑菌活性，再根據(jù)《中國(guó)藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行檢查，并必須對(duì)所采取的檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證，以確認(rèn)抑菌活性的消除和檢查方法的可靠性。具有抑菌作用的藥品，每個(gè)品種抑菌效果不同，因此適合各個(gè)品種的微生物限度檢查法也不同。
作者曾用常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法及薄膜過(guò)濾法（用ph7.0氯化鈉?蛋白胨緩沖液沖洗）對(duì)硝酸咪康唑搽劑進(jìn)行微生物限度檢查，結(jié)果均不能達(dá)到藥典要求。吐溫80是親水性表面活性劑，具有增溶作用，因此本文選擇用薄膜過(guò)濾法聯(lián)用0.1%吐溫80?ph7.0氯化鈉?蛋白胨緩沖溶液做沖洗劑檢查該藥品的細(xì)菌、真菌、酵母菌數(shù)和控制菌，結(jié)果滿意，可為同類藥品的微生物限度檢查法提供科學(xué)依據(jù)。
1材料
1.1菌種大腸埃希菌(escherichia coli)［cmcc(b) 44 102］, 金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus)［cmcc(b) 26 003］, 枯草芽孢桿菌(bacillus subtilis)［cmcc（b）63 501］, 金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus)［cmcc(b) 26 003］，銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa）［cmcc(b)10 104］白色念珠菌(candida albicans)［cmcc(f) 980011］, 黑曲霉(asperg illus niger)［cmcc(f) 98003］，由廣東生物研究所提供，菌種代數(shù)均為第3代。
1.2培養(yǎng)基及試劑ph7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液、0.1%吐溫80?ph7.0氯化鈉?蛋白胨緩沖液、營(yíng)養(yǎng)肉湯、改良馬丁培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、虎紅培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂、二鹽酸二甲基對(duì)苯二胺試劑、pdp瓊脂培養(yǎng)基、三氯甲烷、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基和革蘭氏染色劑。
1.3樣品硝酸咪康唑搽劑，阿特維斯（佛山）制藥有限公司，批號(hào)：0606950，成分：硝酸咪康唑、玫瑰麝香香精、乙醇、二甲基亞砜。
2方法與結(jié)果
2.1菌液制備［1］
2.1.1取經(jīng)37 ℃ 培養(yǎng)18～24 h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌與大腸埃希菌的肉湯培養(yǎng)物1 ml，加入9 ml 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋并制成每1 ml中含菌數(shù)50～100 cfu的菌懸液，做活菌計(jì)數(shù)。
2.1.2取經(jīng)25 ℃培養(yǎng)18～24 h的白色念珠菌液體培養(yǎng)物1 ml，加入9 ml 0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋并制成每1 ml中含菌數(shù)50～100 cfu的菌懸液，做活菌計(jì)數(shù)。
2.1.3接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5～7 d，加入3～5 ml 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1 ml含孢子數(shù)50～100 cfu的孢子懸液，做活菌計(jì)數(shù)。
2.2供試液的制備［2］取本品10 ml，加ph7.0無(wú)菌氯化鈉?蛋白胨緩沖液至100 ml，混勻，作為1∶10的供試液。
2.3驗(yàn)證方法
2.3.1細(xì)菌、真菌和酵母菌計(jì)數(shù)法回收率的測(cè)定
薄膜過(guò)濾法聯(lián)用0.1%吐溫80?ph7.0氯化鈉?蛋白胨緩沖溶液作沖洗劑對(duì)各試驗(yàn)菌的回收率進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，3次獨(dú)立平行試驗(yàn)結(jié)果的均值見(jiàn)表1［3］。
①試驗(yàn)組：取供試液10 ml到薄膜過(guò)濾器中,用無(wú)菌的0.1%吐溫80?ph7.0氯化鈉?蛋白胨緩沖溶液沖洗3次，每次100 ml, 并在最后1次沖洗液中加入1 ml的試驗(yàn)菌液（50～100 cfu/ml）沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于預(yù)先制備好的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或虎紅培養(yǎng)基平板上，置30～35 ℃培養(yǎng)48 h或23～28 ℃培養(yǎng)72 h。記錄菌落數(shù)。試驗(yàn)組的菌回收率=(試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù))÷菌液組的平均菌落數(shù)×100%。
②菌液組［4］：在過(guò)濾器中預(yù)先加入大約20 ml的無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液，再吸取1 ml的試驗(yàn)菌液（50～100 cfu/ml）到過(guò)濾器中，過(guò)濾。再用100 ml無(wú)菌的0.1%吐溫80?ph7.0氯化鈉?蛋白胨緩沖液沖洗1次，取出濾膜，菌面朝上貼于預(yù)先制備好的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或虎紅培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，培養(yǎng)方法同試驗(yàn)組。
③供試品對(duì)照組：方法同試驗(yàn)組，但不加試驗(yàn)菌液。
④稀釋劑對(duì)照組：方法與試驗(yàn)組同，其中供試液用ph7.0氯化鈉?蛋白胨緩沖液代替。稀釋劑對(duì)照組的菌回收率=稀釋劑對(duì)照組平均菌落數(shù)÷菌液組的平均菌落數(shù)×100%
表1各試驗(yàn)菌株的回收率 略
從表1可知，在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的菌回收率、試驗(yàn)組的菌回收率均不低于70%?？捎帽∧み^(guò)濾法聯(lián)用0.1%吐溫80?ph7.0氯化鈉?蛋白胨緩沖液沖洗方法檢查硝酸咪康唑搽劑的細(xì)菌、真菌及酵母菌數(shù)。
2.3.2控制菌檢查方法驗(yàn)證
①試驗(yàn)組：取供試液10 ml到薄膜過(guò)濾器中, 用無(wú)菌的0.1%吐溫80?ph7.0氯化鈉?蛋白胨緩沖液沖洗3次，每次100 ml, 并在最后一次沖洗液中加入50～100 cfu的試驗(yàn)菌（驗(yàn)證銅綠假單胞菌時(shí),試驗(yàn)菌為銅綠假單胞菌），沖洗后取出濾膜放入預(yù)先制備好的相應(yīng)培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法檢查。
②陰性菌對(duì)照組：方法同試驗(yàn)組，試驗(yàn)菌改為50～100 cfu陰性對(duì)照菌（2個(gè)控制菌驗(yàn)證的陰性對(duì)照菌均為大腸埃希菌）。
③菌液組 ：在過(guò)濾器中預(yù)先加入約20 ml的無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液，在吸取50～100 cfu試驗(yàn)菌到薄膜過(guò)濾器中，用100 ml 0.1%吐溫80?ph7.0氯化鈉?蛋白胨緩沖液沖洗1次。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于預(yù)先制備好營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，置（36±1）℃培養(yǎng)48 h，記錄活菌數(shù)［5］。
3次平行試驗(yàn)結(jié)果一致，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。
表2對(duì)銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的驗(yàn)證結(jié)果 略
從表2可見(jiàn)，用薄膜過(guò)濾法聯(lián)用0.1%吐溫ph7.080?氯化鈉?蛋白胨緩沖溶液作沖洗劑檢查銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌，方法成立。
3討 論
硝酸咪康唑搽劑為廣譜抗真菌藥，主要含有硝酸咪康唑、乙醇和二甲基亞砜等成分，對(duì)皮膚癬菌、念珠菌等有抗菌作用，對(duì)某些細(xì)菌也有一定抑制作用?！吨袊?guó)藥典》2005版規(guī)定，對(duì)藥品在微生物限度檢查時(shí)，其方法應(yīng)通過(guò)驗(yàn)證，以確認(rèn)供試品的抑菌活性已被消除而保證檢查方法的可靠性。從本品的微生物限度檢查法的建立研究可見(jiàn)，選用薄膜過(guò)濾法聯(lián)用0.1%吐溫80?ph7.0氯化鈉?蛋白胨緩沖液作沖洗劑來(lái)檢查本品的細(xì)菌數(shù)、真菌、酵母菌數(shù)及控制菌（銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌）的方法有效，在細(xì)菌總數(shù)、真菌及酵母菌計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)中，試驗(yàn)菌回收率均能達(dá)到70%以上；銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌檢查實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)組呈陽(yáng)性反應(yīng)，陰性菌對(duì)照組呈陰性反應(yīng)。本文結(jié)果可為同類產(chǎn)品的微生物限度檢查方法驗(yàn)證提供科學(xué)的依據(jù)。
【摘要】在醫(yī)學(xué)微生物學(xué)和免疫學(xué)課堂教學(xué)中，采用循序漸進(jìn)的原則、多媒體課件教學(xué)、運(yùn)用恰當(dāng)?shù)谋扔?、采用啟發(fā)式教學(xué)、注重歸納總結(jié)、加強(qiáng)綜合應(yīng)用的訓(xùn)練，能有效提高課堂教學(xué)質(zhì)量。
【關(guān)鍵詞】醫(yī)學(xué)微生物學(xué)和免疫學(xué) 課堂教學(xué)質(zhì)量
醫(yī)學(xué)微生物學(xué)和免疫學(xué)是一門重要的醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)課，與其他基礎(chǔ)課和臨床課聯(lián)系緊密。醫(yī)學(xué)微生物學(xué)所研究的對(duì)象體積微小、內(nèi)容瑣碎復(fù)雜；而免疫學(xué)內(nèi)容大多是深入到分子水平、概念多、抽象、前后章節(jié)內(nèi)容環(huán)環(huán)相扣、邏輯推理性強(qiáng)。因此在課程教學(xué)中難度較大。筆者在十幾年的教學(xué)實(shí)踐中積累了一些經(jīng)驗(yàn)，就如何提高醫(yī)學(xué)微生物學(xué)和免疫學(xué)課堂的教學(xué)質(zhì)量，談幾點(diǎn)體會(huì)。
1 修訂部頒教學(xué)大綱，使教學(xué)內(nèi)容更符合臨床實(shí)際
修訂部頒教學(xué)大綱的部分內(nèi)容相對(duì)于新版教材和臨床實(shí)際顯得有些落后，我們與臨床教研室經(jīng)驗(yàn)豐富的教師經(jīng)過(guò)反復(fù)研究，對(duì)原教學(xué)大綱進(jìn)行修改。刪去免疫學(xué)應(yīng)用中的補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)、增補(bǔ)補(bǔ)體mbl激活途徑；根據(jù)認(rèn)知規(guī)律按抗原、免疫器官、免疫細(xì)胞、免疫分子、免疫應(yīng)答、免疫學(xué)應(yīng)用的順序進(jìn)行講解。微生物部分將以前要求掌握的脊髓灰質(zhì)炎病毒改為了解內(nèi)容；將奈瑟氏菌屬、人類免疫缺陷病毒、密螺旋體屬等內(nèi)容改為掌握；增補(bǔ)冠狀病毒、禽流感病毒、霍亂弧菌o139、朊粒等較新的內(nèi)容；增補(bǔ)新發(fā)現(xiàn)的“超級(jí)細(xì)菌”內(nèi)容；結(jié)合學(xué)生大多來(lái)自農(nóng)林牧區(qū)的特點(diǎn)，特將布魯菌屬、森林腦炎病毒作為掌握內(nèi)容。修改后的大綱突出重點(diǎn)、兼顧全面、刪繁就簡(jiǎn)、循序漸進(jìn)，力求教學(xué)的先進(jìn)性與實(shí)用性，做到了理論聯(lián)系實(shí)際。
2 采用多種方法提高學(xué)生學(xué)習(xí)醫(yī)學(xué)微生物學(xué)和免疫學(xué)的興趣
近年來(lái)進(jìn)入中專學(xué)校的學(xué)生大多學(xué)習(xí)基礎(chǔ)差，中專所學(xué)知識(shí)內(nèi)容與初中不同，內(nèi)容多而深。因此，學(xué)生對(duì)基本概念和基本理論的理解能力差；對(duì)物質(zhì)結(jié)構(gòu)的空間想象力差；邏輯思維能力和解決問(wèn)題的能力差，而這些又是促成大多數(shù)學(xué)生對(duì)學(xué)習(xí)興趣低的原因。
美國(guó)心理學(xué)家布魯納提出：“學(xué)習(xí)的最好刺激就是對(duì)相應(yīng)內(nèi)容產(chǎn)生濃厚的興趣?！币虼耍谥v緒論和新的學(xué)習(xí)內(nèi)容時(shí)，我都精心設(shè)計(jì)，激發(fā)學(xué)生對(duì)所要學(xué)的內(nèi)容產(chǎn)生濃厚的興趣，以調(diào)動(dòng)學(xué)生們學(xué)習(xí)的積極性和主動(dòng)性。例如：在講微生物及免疫學(xué)的發(fā)展簡(jiǎn)史、補(bǔ)體、革蘭氏染色等內(nèi)容時(shí)，就以微生物及免疫學(xué)科學(xué)家（列文·虎克、革蘭等）的真實(shí)事跡作為輔助教學(xué)的重要手段，通過(guò)介紹主人公當(dāng)時(shí)發(fā)現(xiàn)問(wèn)題的背景，遇到過(guò)哪些問(wèn)題及如何解決問(wèn)題的過(guò)程，最終得出什么結(jié)論以及有何意義。不僅激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，而且培養(yǎng)了學(xué)生發(fā)現(xiàn)、分析及解決問(wèn)題的能力。例如在講ⅰ型超敏反應(yīng)一節(jié)時(shí)，筆者導(dǎo)入一些人（身邊熟悉的老師及學(xué)生）在日常生活中因冷熱、接觸某些食物、花粉、紫外線等過(guò)敏；母親因接觸了嬰兒含有青霉素的尿液而使其過(guò)敏性休克而死亡的案例；我又講授蠶豆過(guò)敏癥、面食過(guò)敏癥、蘑菇過(guò)敏癥等的臨床表現(xiàn)，提高了學(xué)生的興趣與求知欲，授課效果相當(dāng)好。
授課內(nèi)容緊貼生活實(shí)際，能提高教學(xué)效果。例如：在講消毒滅菌這一節(jié)內(nèi)容時(shí)，在煮沸的水中加入小蘇打，不僅提高殺菌力，又可防止金屬器械生銹。就濕熱和干熱哪種消毒效果好進(jìn)行討論，讓同學(xué)們以日常生活體會(huì)（移動(dòng)熱物品時(shí)用干手巾還是濕手巾、皮膚容易被水蒸氣燙傷）進(jìn)行總結(jié)。
在教學(xué)中選擇能突出微生物及免疫學(xué)重要基本理論的臨床問(wèn)題，這樣就避免理論教學(xué)的枯燥與乏味，能活躍課堂氣氛，提高學(xué)生學(xué)習(xí)興趣和教學(xué)效果，也能提高學(xué)生解決實(shí)際問(wèn)題的能力。例如：輸血時(shí)為什么要做和怎么做交叉配血實(shí)驗(yàn)、兒童及解放軍等易受傷人群感染破傷風(fēng)后如何治療、治療時(shí)應(yīng)注意哪些問(wèn)題？同種異體器官移植物存活率的高低取決于什么？為什么人對(duì)同一種疾病的抵抗力不同等等。
3 按照免疫應(yīng)答的過(guò)程，采用循序漸進(jìn)的原則講授免疫學(xué)基礎(chǔ)部分
例如在講抗原時(shí)就采用了如圖3—1流程進(jìn)行講解，使學(xué)生不僅掌握了抗原及相關(guān)內(nèi)容，而且對(duì)免疫細(xì)胞、免疫分子和免疫應(yīng)答過(guò)程有了初步認(rèn)識(shí)。在講授免疫細(xì)胞、免疫分子、mhc及免疫應(yīng)答時(shí)則采用圖3—2流程進(jìn)行講解，使學(xué)生對(duì)免疫學(xué)的分子水平有了更深刻的認(rèn)識(shí)，較輕松地就掌握了免疫細(xì)胞及免疫分子之間的相互作用及免疫應(yīng)答等復(fù)雜內(nèi)容。
4 科學(xué)運(yùn)用多媒體課件教學(xué)，提高教學(xué)效果
目前，多媒體技術(shù)在教學(xué)活動(dòng)中應(yīng)用廣泛，越來(lái)越體現(xiàn)出其卓越的性能，針對(duì)微生物及免疫學(xué)課程的內(nèi)容抽象、較難理解特點(diǎn)，將多媒體教學(xué)與傳統(tǒng)教學(xué)合理配合，能將抽象的變?yōu)橹苯拥?、靜態(tài)的變?yōu)閯?dòng)態(tài)的、繁雜的變?yōu)楹?jiǎn)單的，能充分調(diào)動(dòng)、激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)的興趣和觀察及思考能力，也便于學(xué)生對(duì)免疫學(xué)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的深刻理解，而且學(xué)生對(duì)所學(xué)內(nèi)容記憶深刻，大大提高了課堂教學(xué)效果。例如：免疫球蛋白水解片段的講授、k細(xì)胞的adcc效應(yīng)、補(bǔ)體的經(jīng)典激活途徑、金黃色葡萄球菌引起燙傷樣皮膚綜合征、艾滋病臨床表現(xiàn)等。
5 運(yùn)用恰當(dāng)?shù)谋扔鳎瑢⒊橄髢?nèi)容形象化、生動(dòng)化
在講授免疫系統(tǒng)時(shí)，將中樞免疫器官(骨髓與胸腺)比作是t、b細(xì)胞“革命圣地延安”，t、b細(xì)胞在此發(fā)育分化成熟，并學(xué)會(huì)了“認(rèn)清敵我”（識(shí)別）的本領(lǐng)后離開(kāi)，到外周免疫器官（淋巴結(jié)、脾臟等）開(kāi)展工作，并不斷巡視（淋巴再循環(huán)），一旦出現(xiàn)（衰老死亡和突變的細(xì)胞、病原微生物等抗原性異物侵入）情況，t、b細(xì)胞立刻識(shí)別并在接收到“雞毛信”（雙信號(hào)）后分化增殖為效應(yīng)t細(xì)胞及抗體，它們?cè)佟罢斜I馬”（淋巴因子、穿孔素、顆粒酶、補(bǔ)體、吞噬細(xì)胞、k細(xì)胞等）形成龐大軍隊(duì)以不同方式去“殲滅清除敵人”。
抗原、抗體的特異性好比“鑰匙與鎖”的關(guān)系，“一把鑰匙只能開(kāi)一把鎖”。
將補(bǔ)體激活酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)比作“多米諾骨牌效應(yīng)”。
6 在免疫學(xué)理論教學(xué)中注重采用啟發(fā)式教學(xué)
醫(yī)學(xué)免疫學(xué)知識(shí)連貫性很強(qiáng)，前后章節(jié)內(nèi)容聯(lián)系緊密。因此在教師的教學(xué)及學(xué)生的學(xué)習(xí)過(guò)程中，要正確認(rèn)識(shí)免疫學(xué)結(jié)構(gòu)體系是學(xué)好免疫學(xué)的基礎(chǔ)。否則學(xué)生就會(huì)對(duì)免疫學(xué)的普遍反映是枯燥、難理解、難記憶。因此，教師在授課時(shí)要采用啟發(fā)式教學(xué)。啟發(fā)學(xué)生深入思考、討論，要把前面部分所學(xué)習(xí)的免疫學(xué)基本概念、基本知識(shí)、基本原理有機(jī)地運(yùn)用于對(duì)各種免疫機(jī)制（如抗原識(shí)別機(jī)制、抗體免疫效應(yīng)機(jī)制、ctl/nk/k細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的機(jī)制、各型超敏反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制、各種臨床常用免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)及防治的原理）的學(xué)習(xí)和領(lǐng)會(huì)中去。更要注重啟發(fā)學(xué)生運(yùn)用所學(xué)的免疫學(xué)知識(shí)認(rèn)識(shí)、理解臨床實(shí)際問(wèn)題，臨床應(yīng)用某些抗生素及抗體制劑時(shí)應(yīng)該注意什么問(wèn)題，怎樣避免或減少超敏反應(yīng)的發(fā)生？器官移植為什么要做組織細(xì)胞配型？這樣學(xué)習(xí)既能學(xué)以致用，又能反過(guò)來(lái)促進(jìn)、加深學(xué)生對(duì)免疫學(xué)的認(rèn)識(shí)理解。
7 加強(qiáng)綜合應(yīng)用的練習(xí)，注重歸納總結(jié)
俗話說(shuō)得好，“熟能生巧”。成功的關(guān)鍵在于勤學(xué)苦練。練習(xí)的意義在于檢驗(yàn)自己，對(duì)學(xué)習(xí)形成反饋調(diào)節(jié)，提高學(xué)習(xí)效果。學(xué)生通過(guò)做練習(xí)可以發(fā)現(xiàn)自己在學(xué)習(xí)中的薄弱環(huán)節(jié)、認(rèn)識(shí)中的片面和錯(cuò)誤，檢驗(yàn)學(xué)習(xí)的效果，同時(shí)又是一種將所學(xué)書本知識(shí)加以運(yùn)用以解決問(wèn)題的實(shí)習(xí)機(jī)會(huì)。教師通過(guò)學(xué)生做練習(xí)，可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)學(xué)生存在的問(wèn)題，做到真正地因材施教、有的放矢，提高教學(xué)質(zhì)量。
在此基礎(chǔ)上還要引導(dǎo)學(xué)生進(jìn)一步橫向比較，在深層次上掌握基本知識(shí)及基本概念。如抗體與免疫球蛋白的區(qū)別、補(bǔ)體活化經(jīng)典途徑、旁路途徑及mbl途徑的區(qū)別、tcr與bcr的區(qū)別、mhc—ⅰ和mhc－ⅱ類分子的區(qū)別、病毒與細(xì)菌的主要區(qū)別、致病性葡萄球菌與鏈球菌在致病因素和在引起局部化膿性感染時(shí)各有何特點(diǎn)？能引起食物中毒的細(xì)菌有哪些等。通過(guò)總結(jié)學(xué)生們才能更加深刻理解，更好地記憶，從而學(xué)好微生物學(xué)及免疫學(xué)。
只有激發(fā)起學(xué)生學(xué)習(xí)微生物學(xué)及免疫學(xué)的興趣，把抽象問(wèn)題形象化、生動(dòng)化，充分發(fā)揮現(xiàn)代化教學(xué)優(yōu)勢(shì)，采用啟發(fā)式教學(xué)，深入思考討論，歸納總結(jié)，微生物學(xué)及免疫學(xué)的課堂教學(xué)質(zhì)量一定會(huì)得到提高。
作者：崔浩然，牛小宇，劉春生
【摘要】 植物體內(nèi)大量分布的微生物對(duì)植物產(chǎn)生的影響已成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)，特別是那些有益的影響可對(duì)植物的生長(zhǎng)及活性成分的形成產(chǎn)生一定的作用。甘草作為一種大宗中藥，其栽培品的質(zhì)量一直是人們所關(guān)心的問(wèn)題，甘草有益微生物對(duì)提高甘草的品質(zhì)有重要作用。該文綜述了甘草有益微生物的研究進(jìn)展，以期對(duì)提高栽培甘草的質(zhì)量起到指導(dǎo)意義。
【關(guān)鍵詞】 甘草; 內(nèi)生菌; 根瘤菌; 菌根真菌
甘草是豆科甘草屬(glycyrrhiza)植物，其根及根莖為常用中藥，市場(chǎng)需求量大。近年來(lái)，隨著野生甘草資源的急劇減少，且國(guó)家明令禁止采挖野生甘草，使甘草供求矛盾日益尖銳。在這種情況下，對(duì)甘草資源的保護(hù)性利用及栽培甘草勢(shì)在必行。近年來(lái)，隨著人工甘草種植面積的逐年加大，提高甘草的質(zhì)量成為亟待解決的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。相關(guān)研究表明，植物有益微生物可以產(chǎn)生促植物生長(zhǎng)的活性物質(zhì)，提高植物固氮性能，促進(jìn)植物對(duì)惡劣環(huán)境的適應(yīng)，加強(qiáng)系統(tǒng)的生態(tài)平衡，保證寄主植物健康生長(zhǎng)。因此本文就近年來(lái)甘草有益微生物的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期對(duì)提高栽培甘草的質(zhì)量有指導(dǎo)意義。
1 甘草內(nèi)生菌的研究現(xiàn)狀
內(nèi)生菌是指一生或至少一生中的某個(gè)階段能進(jìn)入活體植物組織內(nèi)，并且不引起明顯組織變化的真菌或細(xì)菌［1,2］。1993年，strobel等［3］從短葉紅豆杉taxus brevifolia nutt的樹(shù)皮中分離出二百多種微生物，其中有一株內(nèi)生真菌taxomyces andreanae能產(chǎn)生紫杉醇，這一研究結(jié)果引起學(xué)者對(duì)內(nèi)生菌的廣泛興趣。目前，人們已經(jīng)從長(zhǎng)春花、千層塔、銀杏、厚樸等多種植物中分離得到了內(nèi)生菌，并取得了一些成果。
有學(xué)者對(duì)甘草內(nèi)生菌也進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌對(duì)甘草產(chǎn)生一系列作用。宋素琴等［4］對(duì)采自新疆的健康野生脹果甘草不同組織中的內(nèi)生菌進(jìn)行分離，并純化得到149株細(xì)菌和2株真菌，鑒定得出149株細(xì)菌分屬于13個(gè)屬，2株真菌分屬于青霉菌屬penicillium和鐮刀菌屬fusarium。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌可通過(guò)拮抗病原菌促進(jìn)甘草生長(zhǎng)。饒小莉等［5］從烏拉爾甘草健康植株的根莖葉中共分離到內(nèi)生細(xì)菌98株，并采用平板對(duì)峙方法篩選出6株菌株，其對(duì)植物病原菌有明顯體外拮抗活性，鑒定這6株拮抗菌株分屬萎縮芽孢桿菌(bacillus atrophaeus)、多粘類芽孢桿菌(paenibacillus polymyxa)、枯草芽孢桿菌(bacillus subtilis)、paenibacillus ehimensis。龔明福等［6］采用無(wú)菌操作技術(shù)從野生健康甘草glycyrrhiza uralensis的根、莖、葉、種子、根瘤等組織中分離出內(nèi)生細(xì)菌（endophytic bacteria)125株，其中31株對(duì)棉花枯萎病菌(fusarium oxysporum)、棉花黃萎病菌(verticillium dahliae)具有較強(qiáng)的拮抗活性，這31株內(nèi)生細(xì)菌分屬于氣芽孢桿菌屬(aerobacillus sp.)、氣單胞菌屬(aeromonas sp.)、芽孢桿菌屬(bacillus sp.)、黃單孢桿菌屬(xanthomonas sp.)、假單胞桿菌屬(pseudomonas sp.)、土壤桿菌屬(agrobacterium sp.)。另有研究發(fā)現(xiàn)，從甘草中分離的有些內(nèi)生菌還可產(chǎn)生活性物質(zhì)。韋革宏等［7］從烏拉爾甘草和光果甘草中共分離得到68株內(nèi)生菌，從中篩選出一個(gè)來(lái)自烏拉爾甘草的菌株mesorhizobium sp. ccnwgx022，從該菌株發(fā)酵液的石油醚提取物中分離得到了十八烷酸內(nèi)酯rhizobialide，是第一次從內(nèi)生菌中得到此類物質(zhì)。另有學(xué)者研究了內(nèi)生菌在甘草不同部位及不同月份的數(shù)量變化趨勢(shì)。林世利等［8］分離出不同月份苦豆子、駱駝刺、苜蓿、鈴鐺刺、甘草不同部位的內(nèi)生細(xì)菌，研究阿拉爾地區(qū)豆科植物內(nèi)生細(xì)菌種群動(dòng)態(tài)。結(jié)果顯示5月份的苦豆子和甘草植株、8月份的苜蓿植株、9月份的鈴鐺刺和駱駝刺植株的內(nèi)生細(xì)菌的種類最多。內(nèi)生細(xì)菌種類的分布規(guī)律依次為苦豆子中葉＞莖＞根＞種子＞花，苜蓿中根＞葉＞莖＞花＞種子，鈴鐺刺中莖＞葉＞種子＞花＞根，駱駝刺中根＞莖≥葉＞種子＞花，甘草中莖＞根＞葉＞種子＞花。5種豆科植物生長(zhǎng)期中總帶菌量平均值在各個(gè)月份變化趨勢(shì)不同，并且各個(gè)月份的帶菌量處于交替變化之中，說(shuō)明不同月份5種豆科植物內(nèi)生細(xì)菌的種類和數(shù)量不同，同種豆科植物不同組織部位的內(nèi)生細(xì)菌的種類和數(shù)量有差異。
2 甘草根瘤菌的研究現(xiàn)狀
根瘤菌是與豆科植物共生，形成根瘤并固定空氣中的氮?dú)夤┲参餇I(yíng)養(yǎng)的一類桿狀細(xì)菌。這種共生體系具有很強(qiáng)的固氮能力。根瘤菌分快生和慢生兩種類型，為化能異養(yǎng)菌。目前有學(xué)者已經(jīng)從甘草中分離得到根瘤菌并進(jìn)行了一些相關(guān)研究。
目前對(duì)甘草根瘤菌的研究多體現(xiàn)在根瘤菌的分類上。楊雪穎等［9］通過(guò)對(duì)西北干旱半干旱地區(qū)68株甘草根瘤菌的表型多樣性和抗逆性分離研究，發(fā)現(xiàn)1個(gè)新類群和1個(gè)具有較高抗逆性的菌株。對(duì)新類群的中心菌株ccnwgx022和高抗性菌株ccnwgx035進(jìn)行16srdna全序列測(cè)定及系統(tǒng)進(jìn)化研究。結(jié)果表明，ccnwgx022和ccnwgx035與中慢生根瘤菌屬內(nèi)參比菌株的16srdna相似性分別大于96.8％和98.3％，判定它們均屬于中慢生根瘤菌屬。谷峻等［10］采用表型數(shù)值分類、16s rdna pcr-rflp分析和box-pcr指紋圖譜分析的方法對(duì)中國(guó)北方地區(qū)的甘草根瘤菌進(jìn)行表型、遺傳多樣性分析。供試菌株在數(shù)值分類聚類分析中約85％的相似水平上產(chǎn)生2個(gè)表觀群，有11株菌未與已知參比菌株聚群。16sr dna pcr-rflp分析表明，供試的20株菌共產(chǎn)生14種遺傳型，表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。box-pcr指紋圖譜分析進(jìn)一步證明與甘草共生的根瘤菌的基因組也具有多樣性。由此得出結(jié)論：在中國(guó)北方地區(qū)與甘草共生的根瘤菌在sinorhizobium、rhizobium和mesorhizobium屬中均有分布。
3 甘草菌根真菌的研究現(xiàn)狀
菌根是土壤中某些真菌與植物根的共生體。凡能引起植物形成菌根的真菌稱為菌根真菌，大部分屬擔(dān)子菌亞門，小部分屬子囊菌亞門。菌根真菌與植物之間建立相互有利、互為條件的生理整體，并各有形態(tài)特征，這是真核生物之間實(shí)現(xiàn)共生關(guān)系的典型代表。根據(jù)形態(tài)和解剖學(xué)的特征，又把菌根分為外生菌根和內(nèi)生菌根兩大類。有學(xué)者對(duì)甘草菌根真菌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)菌根真菌可促進(jìn)甘草的生長(zhǎng)。饒小莉等［11］分離了甘草的va菌根，并用三葉草進(jìn)行單孢繁殖，將繁殖后的菌根真菌回接甘草，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種了菌根真菌的甘草植株筆長(zhǎng)、根粗、莖葉干重和根干重都有較大程度的提高，均比對(duì)照顯著增加，并且不同處理對(duì)植株生長(zhǎng)影響不同，得出結(jié)論接種va菌根真菌顯著促進(jìn)了甘草的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。jingnan liu等［12］用兩種am菌根真菌glomus mosseae與glomus versiforme接種甘草，結(jié)果顯示接種的甘草相對(duì)于對(duì)照組在生長(zhǎng)的早期和晚期有顯著提高，葉攝取磷的量比對(duì)照組多，并且根中甘草酸的濃度有所升高，但根部氧化酶活性相對(duì)降低了，由此得出結(jié)論接種am菌根真菌有可能成為提高甘草藥用價(jià)值的有效途徑。
4 甘草其他微生物學(xué)相關(guān)研究現(xiàn)狀
近年來(lái)，對(duì)甘草微生物學(xué)轉(zhuǎn)化等方面的研究工作也取得了一定成果。謝毛成［13］利用發(fā)根農(nóng)桿菌的ri質(zhì)粒，以光果甘草種子胚萌發(fā)形成的實(shí)生苗不同部位為外植體，成功誘導(dǎo)出光果甘草毛狀根，并利用tldna中rolc序列中的特異性引物，應(yīng)用pcr技術(shù)對(duì)光果甘草毛狀根進(jìn)行了分子水平的鑒定，并利用理化手段對(duì)毛狀根轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生的冠瘦堿進(jìn)行了薄層定性鑒定，從不同水平上證實(shí)了光果甘草毛狀根核基因組中已整合了外源ri質(zhì)粒的t-dna片段。燕飛等［14］利用發(fā)根農(nóng)桿菌r1601對(duì)藥用植物脹果甘草(glycyrrhiza inflat bat)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)其產(chǎn)生發(fā)根。在發(fā)根誘導(dǎo)過(guò)程中，分別用不同菌液濃度、不同浸染時(shí)間對(duì)脹果甘草子葉、胚軸進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理，統(tǒng)計(jì)、比較各條件下的發(fā)根率，結(jié)果表明，用稀釋2倍的菌液浸染子葉8 min時(shí)，發(fā)根誘導(dǎo)率最高,為56.49%。何晨等［15］用一株產(chǎn)β-葡糖醛酸酶的菌種hc-12對(duì)甘草進(jìn)行液體發(fā)酵轉(zhuǎn)化。通過(guò)對(duì)菌種復(fù)合誘變以及應(yīng)用系統(tǒng)數(shù)值化及靈敏值系統(tǒng)調(diào)控技術(shù)優(yōu)化了發(fā)酵工藝，把甘草中不足0.1%的甘草次酸的含量提高了20倍以上。經(jīng)過(guò)柱層析及hplc及1h nmr鑒定分離得到了甘草次酸純品，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了發(fā)酵甘草于未發(fā)酵的生品對(duì)照甘草具有抗炎活性和鎮(zhèn)痛作用顯著性效果。
5 小結(jié)
內(nèi)生菌對(duì)甘草的有益作用體現(xiàn)在：①內(nèi)生菌有促進(jìn)甘草生長(zhǎng)作用，內(nèi)生菌可與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)或直接產(chǎn)生拮抗物質(zhì)而抑制病原菌，從而促進(jìn)甘草生長(zhǎng)。②有些內(nèi)生菌可產(chǎn)生活性物質(zhì)。③內(nèi)生菌在甘草不同部位及不同月份的數(shù)量呈現(xiàn)一定的變化趨勢(shì)。另有研究表明，內(nèi)生菌能產(chǎn)生與宿主相同的活性物質(zhì)［3］，王興紅［16］推測(cè)內(nèi)生真菌可能與中藥的道地性有密切的關(guān)系。這些成果對(duì)于甘草內(nèi)生菌的研究有重要意義。
根瘤菌對(duì)甘草的有益作用體現(xiàn)在：根瘤菌能夠通過(guò)與甘草共生，引起甘草根部或莖部結(jié)瘤，將空氣中的n2轉(zhuǎn)化為可吸收利用的nh4，從而為甘草提供氮素營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)其生長(zhǎng)。
菌根真菌對(duì)甘草的有益作用體現(xiàn)在：甘草和菌根真菌是一種互惠共生的關(guān)系，它們之間可以交換各自所需的物質(zhì)，甘草借助菌根真菌吸收水分、養(yǎng)分和生長(zhǎng)促進(jìn)劑，而菌根真菌也從甘草中攝取自身生長(zhǎng)所需要的糖分和其它有機(jī)物。菌根真菌是根系的延長(zhǎng)和擴(kuò)展，且比根系吸收水分、養(yǎng)分的能力大得多，可促進(jìn)甘草的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，提高甘草的藥用價(jià)值。
微生物轉(zhuǎn)化對(duì)甘草的作用體現(xiàn)在：對(duì)甘草進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，可提高其有效成分含量，用藥效果可得到提高。
總之，微生物是個(gè)潛力巨大、尚待開(kāi)發(fā)的資源，對(duì)甘草相關(guān)微生物進(jìn)行研究有重大意義，有利于提高甘草的質(zhì)量，對(duì)于中藥的可持續(xù)發(fā)展也將起到重大作用。
論文關(guān)鍵詞：微生物 實(shí)驗(yàn) 互動(dòng) 研究
論文摘 要：環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)是環(huán)境學(xué)領(lǐng)域的一門重要基礎(chǔ)課程。本文以傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)方式為基礎(chǔ)，提出了以“先立觀念，互動(dòng)教學(xué)，科研教學(xué)”實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式為核心的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，并從中獲得了一些啟發(fā)與體會(huì)。
環(huán)境微生物學(xué)作為環(huán)境工程專業(yè)、環(huán)境科學(xué)專業(yè)的必修專業(yè)基礎(chǔ)課，是以普通微生物學(xué)為基礎(chǔ)，并在研究微生物學(xué)的一般規(guī)律的同時(shí)，更注重微生物與環(huán)境之間的相互作用規(guī)律的一門課程[1]。環(huán)境微生物是微觀的、肉眼看不見(jiàn)的，需要抽象思維，總體而言枯燥乏味。所學(xué)知識(shí)雖與專業(yè)相關(guān)，但學(xué)生尚未接觸科學(xué)研究，所學(xué)內(nèi)容離日常生活較遠(yuǎn)，學(xué)習(xí)目的性大打折扣，難以激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣。因此，與其他專業(yè)的微生物課程類似，在進(jìn)行環(huán)境微生物學(xué)的理論教學(xué)的同時(shí)，配合一定課時(shí)量的實(shí)驗(yàn)教學(xué)，以其調(diào)動(dòng)學(xué)生對(duì)理論學(xué)習(xí)的興趣，提高對(duì)理論知識(shí)的認(rèn)知能力。
另一方面，隨著環(huán)境微生物學(xué)的發(fā)展，例如無(wú)菌操作、培養(yǎng)基制備、消毒與滅菌、微生物的培養(yǎng)分離計(jì)數(shù)等微生物學(xué)中最基本的一些技術(shù)在環(huán)境污染處理等生產(chǎn)研究領(lǐng)域中應(yīng)用十分廣泛，對(duì)整個(gè)科學(xué)技術(shù)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展發(fā)揮著重大作用。因而，微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)也是課程理論與實(shí)踐應(yīng)用相結(jié)合的橋梁和紐帶，在學(xué)生專業(yè)技能培養(yǎng)中具有十分重要的作用。那么，如何充分調(diào)配環(huán)境微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容及授課方式，讓學(xué)生真正掌握所學(xué)知識(shí)，培養(yǎng)具備理論知識(shí)扎實(shí)、動(dòng)手能力強(qiáng)且能將所學(xué)知識(shí)靈活運(yùn)用創(chuàng)新能力的學(xué)生，一直是值得思考和努力的問(wèn)題。本文根據(jù)環(huán)境微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)過(guò)程中存在的問(wèn)題，提出了“先立觀念，互動(dòng)教學(xué)，科研教學(xué)”為中心思想的教學(xué)方法，以其為進(jìn)一步提高環(huán)境微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)效率提供系列應(yīng)對(duì)策略。
1 先立觀念
微生物實(shí)驗(yàn)與物理化學(xué)實(shí)驗(yàn)不同，其研究對(duì)象是形體微小、分布廣泛、無(wú)處不在的細(xì)菌、病毒和真菌。尤其是在進(jìn)行某種微生物的分離、純化及培養(yǎng)過(guò)程中，無(wú)菌操作技術(shù)是整個(gè)實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)。尚未接觸微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的學(xué)生不能深刻注意到與其它學(xué)科實(shí)驗(yàn)的差異。其它學(xué)科實(shí)驗(yàn)的操作是在開(kāi)放的空氣中進(jìn)行的，而微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)尤其是研究工作中，許多實(shí)驗(yàn)操作是在相對(duì)隔離的環(huán)境中進(jìn)行的，以保證不受環(huán)境中微生物的污染。因此，在學(xué)生尚未養(yǎng)成不良實(shí)驗(yàn)習(xí)慣之前，就必須讓其建立無(wú)菌操作的概念。筆者在第一次課堂上，就針對(duì)整個(gè)課程周期內(nèi)的行為規(guī)范要求做一次詳細(xì)說(shuō)明，培養(yǎng)學(xué)生規(guī)范的操作技術(shù)。讓學(xué)生理解什么樣的操作是規(guī)范的，什么樣的操作會(huì)引起實(shí)驗(yàn)的失敗。結(jié)果表明，缺少這部分內(nèi)容的教育，在后面的實(shí)驗(yàn)活動(dòng)中，學(xué)生往往會(huì)不自覺(jué)養(yǎng)成一些不良習(xí)慣，無(wú)菌操作概念則相當(dāng)薄弱。因此，我們強(qiáng)調(diào)先立觀念。大學(xué)的環(huán)境微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是他們第一次接觸微生物，在最初階段就讓學(xué)生知道整個(gè)課程的基本規(guī)范，會(huì)讓他們受益匪淺。
2 互動(dòng)教學(xué)應(yīng)貫穿整個(gè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)
常規(guī)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)，通常由理論教學(xué)和實(shí)驗(yàn)教學(xué)兩部分組成。即，教師講解本次實(shí)驗(yàn)的目的、原理、材料、操作步驟及注意事項(xiàng)，然后學(xué)生各自分組按操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。此處，教師的課前講解是學(xué)生進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的前提與基礎(chǔ)，是學(xué)生是否能充分理解本次實(shí)驗(yàn)流程的關(guān)鍵要素。因此，教師工作者十分關(guān)注如何能提高教師講解的效率以擴(kuò)大學(xué)生的理解[2]。筆者發(fā)現(xiàn)，若將互動(dòng)教學(xué)法引入到實(shí)驗(yàn)課中，同樣十分有效，它是充分發(fā)揮教師和學(xué)生兩個(gè)主觀能動(dòng)性的教學(xué)方法。那么實(shí)驗(yàn)課的互動(dòng)教學(xué)法是以何形式出現(xiàn)的呢？筆者通過(guò)實(shí)踐，摸索出了“問(wèn)答式”、“答問(wèn)式”、“師生討論啟發(fā)式”、“實(shí)驗(yàn)結(jié)果展現(xiàn)”、“多媒體教學(xué)”等多種形式，教師可以根據(jù)不同的教學(xué)內(nèi)容，有選擇地加以使用。
(1)“問(wèn)答式”與“答問(wèn)式”?！皢?wèn)答式”即在講完實(shí)驗(yàn)理論后由教師針對(duì)本次實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵問(wèn)題進(jìn)行提問(wèn)，然后由學(xué)生回答。如“細(xì)菌涂片制備與染色”實(shí)驗(yàn)中，教師可以詢問(wèn)學(xué)生革蘭氏染色的原理與步驟等。這不僅能促進(jìn)學(xué)生理解的效率，還能讓教師從中了解學(xué)生的掌握程度，并可針對(duì)學(xué)生不懂之處解答；“答問(wèn)式”則通常在“問(wèn)答式”之后，即要求學(xué)生針對(duì)實(shí)驗(yàn)提出若干個(gè)問(wèn)題，由教師回答。眾所周知，在大多數(shù)情況下，中國(guó)學(xué)生往往會(huì)帶著疑問(wèn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，直至出現(xiàn)問(wèn)題后才會(huì)找老師解答，或甚至不問(wèn)。而這種情況對(duì)于實(shí)驗(yàn)操作教學(xué)是十分不利的。因此，培養(yǎng)學(xué)生在實(shí)驗(yàn)前把整個(gè)過(guò)程弄明白，不留疑問(wèn)的進(jìn)行后面的實(shí)驗(yàn)，是教師們一直以來(lái)努力的目標(biāo)。筆者發(fā)現(xiàn)，從第一次課程點(diǎn)名鼓勵(lì)提問(wèn)，到后面幾次課的踴躍提問(wèn)，寬松的互動(dòng)問(wèn)題環(huán)節(jié)還是比較受歡迎的。其中有很多問(wèn)題是教師認(rèn)為比較簡(jiǎn)單的一些操作，所以先前并未講解透徹，而學(xué)生卻一知半解。當(dāng)他們提問(wèn)后教師解答，則能讓整個(gè)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行事半功倍。因此，讓學(xué)生習(xí)慣并喜歡“答問(wèn)式”是一個(gè)循序漸進(jìn)的過(guò)程，也是一個(gè)非常有利于教學(xué)效果的方法。
(2)“師生討論啟發(fā)式”分兩種形式，即口頭和書面形式。口頭形式通常在課內(nèi)完成，即在學(xué)生在實(shí)驗(yàn)期間，與老師的交流。如此，使學(xué)生學(xué)到較多實(shí)驗(yàn)知識(shí)與技巧。并且，教師可在下課前集中講解實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)的新現(xiàn)象、新問(wèn)題，糾正學(xué)生常見(jiàn)的習(xí)慣性錯(cuò)誤，培養(yǎng)學(xué)生良好的實(shí)驗(yàn)操作習(xí)慣。書面形式，則是要求同學(xué)在完成課內(nèi)的實(shí)驗(yàn)操作后，實(shí)驗(yàn)報(bào)告除了目的、原理、方法、結(jié)果和思考題外，還應(yīng)有相應(yīng)的分析和討論。以往，學(xué)生撰寫報(bào)告往往把實(shí)驗(yàn)原理、材料、操作方法和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)等簡(jiǎn)單地羅列，未能對(duì)實(shí)驗(yàn)中遇到的問(wèn)題進(jìn)行分析討論。為了使學(xué)生深刻理解和掌握實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，探討成功的經(jīng)驗(yàn)和失敗的原因，提高分析問(wèn)題、提出解決方案和實(shí)施解決方案的能力，筆者要求學(xué)生如實(shí)記錄操作步驟和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，尤其是鼓勵(lì)將操作步驟以圖示的方式表示出來(lái)，而非從資料上抄下來(lái)大段大段的文字。此外，鼓勵(lì)其將實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的各種結(jié)果進(jìn)行分析討論，對(duì)于實(shí)驗(yàn)取得與預(yù)期相符結(jié)果的，分析成功的關(guān)鍵和經(jīng)驗(yàn)。對(duì)于未取得預(yù)期結(jié)果的，分析導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗的原因。對(duì)于學(xué)生提交的實(shí)驗(yàn)報(bào)告，教師在批閱過(guò)程中逐一點(diǎn)評(píng)。筆者在評(píng)閱實(shí)驗(yàn)報(bào)告時(shí)常遇到以下內(nèi)容：“本次實(shí)驗(yàn)失敗了，主要原因可能是培養(yǎng)基制備時(shí)瓊脂濃度過(guò)低”；“這次實(shí)驗(yàn)我們成功分離到了纖維素降解菌”。這讓教師及時(shí)了解學(xué)生對(duì)課程的意見(jiàn)與想法，能促進(jìn)今后課程開(kāi)展的及時(shí)改進(jìn)。
(3)“結(jié)果展現(xiàn)式”應(yīng)用的典型例子就是在“顯微鏡的使用與細(xì)菌形態(tài)觀察”這一實(shí)驗(yàn)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)最主要的目的就是讓學(xué)生通過(guò)顯微鏡的觀察，對(duì)各種微生物細(xì)胞的基本形態(tài)特征有一個(gè)直接的感性認(rèn)識(shí)。筆者所在教學(xué)實(shí)驗(yàn)室建立了一個(gè)互動(dòng)實(shí)驗(yàn)室平臺(tái)，即教師顯微鏡下的視野能直接投影到大屏幕讓全體學(xué)生看到，每組學(xué)生用的顯微鏡視野也能切換到大屏幕上去。如此一來(lái)，所有同學(xué)都能看到老師做的微生物裝片情況，各組之間的情況大家也一目了然。在觀察微生物的形態(tài)、大小時(shí)，學(xué)生對(duì)看到顯微鏡下的物體常有誤認(rèn)。實(shí)驗(yàn)中，常常有學(xué)生把雜質(zhì)當(dāng)作了細(xì)菌細(xì)胞，需經(jīng)過(guò)老師的指點(diǎn)才能看到了真正的細(xì)菌細(xì)胞。在互動(dòng)教室中教師可以在大屏幕上對(duì)每一個(gè)成像進(jìn)行分析辨認(rèn)，從而輕松讓每一個(gè)學(xué)生看到各個(gè)小組制作的真實(shí)菌體。另外，同學(xué)與同學(xué)之間也會(huì)就實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象差異進(jìn)行討論，交流成功或失敗的經(jīng)驗(yàn)。筆者曾對(duì)學(xué)生做了調(diào)查，90%以上同學(xué)都十分認(rèn)可將自己的實(shí)驗(yàn)成果與全班分享。
(4)隨著科學(xué)的發(fā)展，理論部分的教學(xué)已離不開(kāi)多媒體教學(xué)，但實(shí)驗(yàn)教學(xué)大多數(shù)仍保持著固有形式，如板書等。為了能在有限的課時(shí)內(nèi)準(zhǔn)確生動(dòng)地將最基本的操作技術(shù)介紹給學(xué)生，提高實(shí)驗(yàn)課程的教學(xué)水平，我們?cè)趯⒍嗝襟w技術(shù)應(yīng)用到微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)方面進(jìn)行了一些有益的嘗試，受到了學(xué)生的普遍歡迎。即每次課程均會(huì)播放一段教學(xué)視頻，如“培養(yǎng)基的配制與分裝”、“玻璃器皿的包扎”、“細(xì)菌的接種”、“革蘭氏染色”等。通過(guò)生動(dòng)形象的教學(xué)示范，可以讓學(xué)生更為形象的了解微生物操作技術(shù)的細(xì)節(jié)要求，培養(yǎng)出微生物操作技術(shù)更為扎實(shí)的學(xué)生?；蛘咴凇拔鬯谐Ｒ?jiàn)微生物觀察”實(shí)驗(yàn)中，讓學(xué)生觀察后拍攝照片視頻錄像，并對(duì)影響資料進(jìn)行標(biāo)注，如添加標(biāo)尺、調(diào)節(jié)曝光時(shí)間等，通過(guò)提高學(xué)生的興趣來(lái)增強(qiáng)他們對(duì)知識(shí)點(diǎn)的記憶。因此，充分利用多媒體的有利條件，將實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)建立在現(xiàn)代教育技術(shù)的平臺(tái)上應(yīng)逐漸成為當(dāng)前形式下高等教育改革和發(fā)展的目標(biāo)[3]。
3 實(shí)驗(yàn)教學(xué)與科研教學(xué)的關(guān)系
3.1 驗(yàn)證性與研究性教學(xué)的有機(jī)結(jié)合
微生物實(shí)驗(yàn)課的開(kāi)設(shè)大多是根據(jù)理論教學(xué)的進(jìn)度，設(shè)置相對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目來(lái)自實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書，書中從實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、原理、器材、步驟及注意事項(xiàng)等內(nèi)容都作了全面而具體的說(shuō)明，所做實(shí)驗(yàn)基本上都是驗(yàn)證性的，學(xué)生只需照做，最后完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告即可。整個(gè)過(guò)程缺少了能讓學(xué)生好好動(dòng)腦思考的環(huán)節(jié)。雖然，實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的選擇都是從眾多實(shí)驗(yàn)中篩選出來(lái)的具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，但大多是相對(duì)孤立的，學(xué)生會(huì)搞不清實(shí)驗(yàn)一和實(shí)驗(yàn)二之間有沒(méi)有關(guān)系，有沒(méi)有學(xué)的必要。如果，教師將其中一部分驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)行科學(xué)合理的串聯(lián)，使學(xué)生掌握基本操作技術(shù)后，適當(dāng)安排一些研究性的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。將實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目告知學(xué)生，要求學(xué)生參考實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書和相關(guān)的期刊，分組寫出試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行研究性學(xué)習(xí)。教師對(duì)各個(gè)小組進(jìn)行具體指導(dǎo)，包括實(shí)驗(yàn)步驟、實(shí)驗(yàn)所需器材的準(zhǔn)備等。同時(shí)，鼓勵(lì)各小組選擇不同的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，觀察結(jié)果時(shí)互相交流討論。如“污水中大腸菌群的測(cè)定”這一實(shí)驗(yàn)中，可告訴學(xué)生采用中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)gb/t 5750.12-2006中的多管發(fā)酵法，由學(xué)生自行去網(wǎng)絡(luò)資源中查找具體的資料，制作實(shí)驗(yàn)方案，由教師審核后開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。
3.2 研究性與開(kāi)放性教學(xué)的循序漸進(jìn)
雖然，上述研究性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目能培養(yǎng)學(xué)生的獨(dú)立思考及設(shè)計(jì)能力，但是以培養(yǎng)高素質(zhì)的創(chuàng)新人才而言仍然是不夠的。因此，還可開(kāi)設(shè)一些開(kāi)放性實(shí)驗(yàn)課程，即3～4個(gè)學(xué)生組成的項(xiàng)目小組選擇某位專業(yè)指導(dǎo)老師，開(kāi)展一個(gè)結(jié)果未知的研究項(xiàng)目，實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)與科研的真正結(jié)合[4]。如“化工廢水中某降解菌株的篩選分離”、“水體藻類對(duì)某化合污染物的響應(yīng)研究”等。課題組獨(dú)立完成實(shí)驗(yàn)方案實(shí)施的全過(guò)程，指導(dǎo)教師隨時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的技術(shù)重點(diǎn)、難點(diǎn)進(jìn)行指導(dǎo)和把關(guān)。教師除平時(shí)進(jìn)行指導(dǎo)外，還定期組織學(xué)生進(jìn)行學(xué)術(shù)交流。通過(guò)學(xué)術(shù)交流便于指導(dǎo)教師詳細(xì)掌握各組的實(shí)驗(yàn)進(jìn)度、存在問(wèn)題等，并指出努力方向。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每名學(xué)生寫出正式規(guī)格的實(shí)驗(yàn)研究論文，由指導(dǎo)老師進(jìn)行評(píng)定并備案。
總之，以培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新精神和實(shí)踐能力為重點(diǎn)的素質(zhì)教育正在普遍實(shí)施，我們針對(duì)環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)進(jìn)行的一些“互動(dòng)”改革，仍是初步探索，期望能對(duì)進(jìn)一步推動(dòng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的進(jìn)程提供一些新的思路。
摘要 針對(duì)“土壤微生物的分解作用”這個(gè)實(shí)驗(yàn)在教學(xué)中開(kāi)展出現(xiàn)的幾個(gè)問(wèn)題,對(duì)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行了相應(yīng)的改進(jìn),以期對(duì)教學(xué)實(shí)踐有一定的參考價(jià)值。
關(guān)鍵詞 土壤微生物 分解作用 實(shí)驗(yàn)改進(jìn)
“土壤微生物的分解作用”是新課程標(biāo)準(zhǔn)中設(shè)置的一項(xiàng)活動(dòng),旨在使學(xué)生能從實(shí)驗(yàn)的角度去探究土壤中落葉等物質(zhì)的消失源于土壤微生物的分解作用。筆者經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn),浙江省新課程實(shí)施兩年以來(lái),開(kāi)展該實(shí)驗(yàn)的學(xué)校寥寥無(wú)幾,多數(shù)一線教師反映該實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象不明顯,而更主要的是大多學(xué)校不具備實(shí)施該實(shí)驗(yàn)的設(shè)備裝置,鑒于此,下面設(shè)計(jì)了該實(shí)驗(yàn)的3個(gè)改進(jìn)方案,以供大家參考。
1 改進(jìn)方案一
草莓是在土壤微生物的作用下腐爛的嗎?
本實(shí)驗(yàn)采用對(duì)照實(shí)驗(yàn)的方法,設(shè)計(jì)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組的土壤不做任何處理(自然狀態(tài));實(shí)驗(yàn)組的土壤要經(jīng)過(guò)高壓滅菌處理,以盡可能排除土壤微生物的作用,同時(shí)要盡可能避免土壤理化性質(zhì)的改變。所選用的草莓都要進(jìn)行徹底滅菌處理。
(1)實(shí)驗(yàn)材料:土壤、草莓若干(可根據(jù)季節(jié)自行選擇其他水果)、70%的酒精、升汞。
(2)實(shí)驗(yàn)器材:無(wú)菌操作臺(tái)、高壓滅菌鍋、泡沫碗、鏟子、培養(yǎng)皿、鑷子等。
(3)實(shí)驗(yàn)步驟:
①采集土樣。選取適量較肥沃的土壤等量分裝于兩個(gè)泡沫碗中,做好標(biāo)記備用。
③土壤處理。將其中的一碗土壤用報(bào)紙包好,同培養(yǎng)皿、鑷子等一起放入高壓蒸汽滅菌鍋滅菌20 min(實(shí)驗(yàn)組)。另一碗土壤不做處理,保持自然狀態(tài)(對(duì)照組)。
③草莓處理。將所選用的草莓用70%的酒精進(jìn)行10 s消毒處理,并用升汞進(jìn)行20 min滅菌,最后用無(wú)菌水洗3-4次,殺滅草莓表面的微生物。
④將滅菌處理后的草莓分別埋人兩盒土壤中(深3-5 cm),并將2組實(shí)驗(yàn)材料放入無(wú)菌培養(yǎng)室(注意:實(shí)驗(yàn)組要在無(wú)菌條件下操作)。
⑤隔天觀察草莓的腐爛程度,并對(duì)其進(jìn)行描述,得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
(4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:實(shí)驗(yàn)第3 d對(duì)照組開(kāi)始腐爛,第5 d實(shí)驗(yàn)組個(gè)別草莓開(kāi)始有變化;第7 d,實(shí)驗(yàn)組個(gè)別草莓有一定程度腐爛,對(duì)照組幾乎所有草莓都有不同程度腐爛。
(5)實(shí)驗(yàn)結(jié)論:對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組除了對(duì)土壤的處理不同,其他條件完全一樣,實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同,說(shuō)明未經(jīng)滅菌處理的土壤中確實(shí)存在使草莓發(fā)霉的微生物。
2 改進(jìn)方案二
面包是在土壤微生物的作用下腐爛的嗎?
本實(shí)驗(yàn)采用對(duì)照實(shí)驗(yàn)的方法,設(shè)計(jì)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組的土壤不做任何處理(自然狀態(tài));實(shí)驗(yàn)組的土壤要經(jīng)過(guò)處理(在微波爐里加熱10min),以盡可能地排除土壤微生物的作用,同時(shí)要盡可能避免土壤理化性質(zhì)的改變;面包要在微波爐里面進(jìn)行滅菌處理。
(1)實(shí)驗(yàn)材料:土壤、面包。
(2)實(shí)驗(yàn)器材:微波爐、泡沫碗若干、報(bào)紙、鏟子、鑷子、錐形瓶等。
(3)實(shí)驗(yàn)步驟:
①采集土樣。選取適量較肥沃的土壤等量分裝于8個(gè)泡沫碗中,做好標(biāo)記備用。
②土壤處理。將其中的4盆土壤用報(bào)紙包好同鑷子等一起放入微波爐滅菌20 min,該組為實(shí)驗(yàn)組。另4盆土壤不做處理,保持自然狀態(tài),作為對(duì)照組。
③面包處理。將新烤的面包切成若干大小相等的塊狀,放在錐形瓶中,將錐形瓶放到微波爐里加熱,進(jìn)行徹底滅菌處理,殺死面包中含有的微生物。
④滅菌處理后的面包分別埋入8碗土壤中(深3-5cm),用報(bào)紙將泡沫碗包好,并將2組實(shí)驗(yàn)材料放入無(wú)菌培養(yǎng)室(注意:實(shí)驗(yàn)組要在無(wú)菌條件下操作)。
⑤隔天觀察面包的腐爛程度,記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果,一周后,實(shí)驗(yàn)組面包完好,而對(duì)照組面包發(fā)霉。
(4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:實(shí)驗(yàn)第8 d對(duì)照組開(kāi)始發(fā)霉,第10 d對(duì)照組面包上長(zhǎng)滿了長(zhǎng)長(zhǎng)的“毛”,而實(shí)驗(yàn)組完好。
(5)實(shí)驗(yàn)結(jié)論:對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組除了對(duì)土壤的處理不同,其他條件完全一樣,實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同。這說(shuō)明未經(jīng)滅菌處理的土壤中確實(shí)存在使面包變質(zhì)的微生物。
3 改進(jìn)方案三
探究土壤微生物對(duì)淀粉的分解作用。
本探究實(shí)驗(yàn)將對(duì)土壤微生物的分解作用的探究和對(duì)淀粉及還原性糖的鑒定較好的結(jié)合在一起,既能完成新的探究實(shí)驗(yàn),又能對(duì)必修1中的重要實(shí)驗(yàn)“鑒定淀粉和還原性糖”起到很好的復(fù)習(xí)作用。
(1)實(shí)驗(yàn)材料及藥品:土壤、淀粉溶液、蒸餾水、碘液、斐林試劑。
(2)實(shí)驗(yàn)儀器:高壓蒸汽滅菌鍋、燒杯、試管、玻璃棒、膠頭滴管、酒精燈、電子稱等。
(3)實(shí)驗(yàn)步驟:
①將取自農(nóng)田的土壤放入里面墊有紗布的燒杯中,加水?dāng)嚢?然后將紗布連同土壤一起取出,將留在燒杯中的土壤浸出液靜置一段時(shí)間備用。
②取兩只錐形瓶,編號(hào)a、b,放入等量(約30ml)淀粉溶液,高壓蒸汽滅菌20min。
③在a錐形瓶中加入30ml土壤浸出液(實(shí)驗(yàn)組),b錐形瓶中加入30 ml無(wú)菌水(對(duì)照組,需無(wú)菌操作),分別用牛皮紙封口(隔菌通氣)。
④在室溫(20℃左右)下放置7 d后,分別取a、b錐形瓶中的溶液5 ml,各放入兩支試管中,分別編號(hào)a1、a2、b1、b2。
⑤在a1、b1中加入碘液,在a2、b2中加入斐林試劑并在酒精燈上加熱2～3 min。
⑥觀察試管中溶液的顏色變化,記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果,得出實(shí)驗(yàn)結(jié)論。
(4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1周后,a1中加入碘液仍為紫色,b1中加入碘液變?yōu)樗{(lán)色,a2、b2中加入斐林試劑并在酒精燈上加熱2-3min沒(méi)有變化;2周后,a2中加入斐林試劑并在酒精燈上加熱2-3min,變磚紅色,b2中加入斐林試劑并在酒精燈上加熱2-3 min仍無(wú)顏色變化。
(5)實(shí)驗(yàn)結(jié)論:對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組除了對(duì)土壤的處理不同,即所得的土壤浸出液成分不同,其他條件完全一樣,實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)不同的顏色,說(shuō)明了未經(jīng)滅菌處理的土壤得到的土壤浸出液中存在某些微生物,使得淀粉被分解成為還原性糖。
4 總結(jié)
方案一選擇草莓作為材料,周期短,效果好,但有季節(jié)限制;同時(shí)本方案滅菌效果徹底,但對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器的要求也比較高,所以適用于實(shí)驗(yàn)設(shè)備條件較好的中學(xué)?？紤]到有些學(xué)校實(shí)驗(yàn)設(shè)備條件有限,沒(méi)有高壓滅菌鍋、滅菌臺(tái),所以方案二選用微波爐來(lái)滅菌,這是生活中常見(jiàn)的電器容易獲得,適合實(shí)驗(yàn)設(shè)備條件一般的中學(xué);同時(shí)本方案選擇面包作為材料周期較長(zhǎng),但面包價(jià)格便宜,且沒(méi)有季節(jié)限制。教材對(duì)方案三沒(méi)有說(shuō)明加入淀粉糊的濃度和量,以及所加淀粉糊在7 d后是否完全被分解,沒(méi)作鑒定說(shuō)明,這將會(huì)直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本文在教材方案基礎(chǔ)上針對(duì)性的對(duì)其進(jìn)行改進(jìn),并增添了鑒定實(shí)驗(yàn),使得實(shí)驗(yàn)更加嚴(yán)密,提高了可操作性。
論文摘要：微生物課程是生物制藥專業(yè)重要的職業(yè)基礎(chǔ)課程，在本專業(yè)的許多課程教學(xué)中起著承前啟后的作用。本文從生物制藥專業(yè)發(fā)展概況及培養(yǎng)目標(biāo)入手，對(duì)微生物課程教學(xué)地位及教學(xué)目標(biāo)進(jìn)行分析，闡述了微生物課程教學(xué)改革的探索與實(shí)踐。
論文關(guān)鍵詞：高職；生物制藥；微生物課程；教學(xué)改革
生物制藥專業(yè)發(fā)展概況及培養(yǎng)目標(biāo)
生物制藥是運(yùn)用微生物學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)等研究成果并綜合利用微生物學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)、生物技術(shù)、藥學(xué)等科學(xué)的原理和方法制造用于預(yù)防、治療和診斷的制品。生物制藥產(chǎn)業(yè)是國(guó)民經(jīng)濟(jì)的重要組成部分，《中華人民共和國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展第十一個(gè)五年規(guī)劃綱要》和《國(guó)家中長(zhǎng)期科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要（2006-2020年）》中明確指出“要大力發(fā)展生物產(chǎn)業(yè)”。目前，全世界的醫(yī)藥品已有一半是生物合成的。
近年來(lái)，我國(guó)醫(yī)藥行業(yè)的迅猛發(fā)展，特別是生物技術(shù)在醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中的廣泛應(yīng)用大大加快了生物與醫(yī)藥類等高職院校生物制藥專業(yè)的發(fā)展壯大。其培養(yǎng)目標(biāo)是：德、智、體、美全面發(fā)展，具有與本專業(yè)領(lǐng)域方向相適應(yīng)的文化水平與素質(zhì)、良好的職業(yè)道德和創(chuàng)新精神，掌握本專業(yè)領(lǐng)域方向的技術(shù)知識(shí)，具備相應(yīng)實(shí)踐技能以及較強(qiáng)的實(shí)際工作能力，熟練掌握并能從事藥物的研發(fā)、藥物的生產(chǎn)、藥物的質(zhì)量及安全檢驗(yàn)、藥理分析、藥物的經(jīng)營(yíng)和銷售等工作的高技能型人才。
微生物課程教學(xué)地位及教學(xué)目標(biāo)分析
半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，微生物轉(zhuǎn)化在藥物研制中一系列突破性的應(yīng)用給醫(yī)藥工業(yè)創(chuàng)造了巨大的醫(yī)療價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。隨著新微生物資源的發(fā)現(xiàn)、新的藥物篩選模型建立以及各種新技術(shù)的應(yīng)用，從微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物中尋找新藥所顯現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)將繼續(xù)存在，事實(shí)證明微生物制藥在整個(gè)生物制藥產(chǎn)業(yè)中占有舉足輕重的地位。微生物學(xué)在理、工、農(nóng)、醫(yī)、師范院校與生物相關(guān)專業(yè)的課程設(shè)置中占有重要的地位，也是一門實(shí)踐性很強(qiáng)的學(xué)科。
由此可見(jiàn)，微生物課程也必然是生物制藥專業(yè)的重要職業(yè)基礎(chǔ)課程。它系統(tǒng)地介紹了微生物的分布、分類、形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)繁殖、遺傳變異以及與人類生產(chǎn)生活的關(guān)系等理論與實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)，要求學(xué)生具備一定的生物學(xué)與生物化學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)。其后續(xù)課程包括發(fā)酵工程概論、生物技術(shù)制藥、制藥工藝學(xué)、藥品分析與檢驗(yàn)、藥劑學(xué)、藥事管理與基因工程技術(shù)概論等多門主干課程。
本課程的教學(xué)目標(biāo)是使學(xué)生能夠正確掌握微生物分類、結(jié)構(gòu)、生理活動(dòng)等基礎(chǔ)知識(shí)，確保學(xué)生能夠進(jìn)行有關(guān)微生物生產(chǎn)的必要基本技能操作，并掌握應(yīng)用微生物學(xué)理論知識(shí)分析問(wèn)題和解決問(wèn)題的基本方法，從而為后續(xù)的職業(yè)技術(shù)課程的學(xué)習(xí)與生產(chǎn)實(shí)踐奠定必要的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐技能。
微生物課程教學(xué)改革探索與實(shí)踐
長(zhǎng)期以來(lái)，全國(guó)各高校微生物學(xué)教學(xué)大多以課堂講授為主，配合適量實(shí)驗(yàn)課。學(xué)生學(xué)習(xí)微生物學(xué)的方法常常是課上勤筆記少思考、課下不復(fù)習(xí)少作業(yè)，考前死記硬背、考后“完璧歸趙”。為了提高微生物課程教學(xué)效果與學(xué)生的實(shí)踐技能，我們于2008年申報(bào)了《微生物及其應(yīng)用》院級(jí)精品課程，并與全省其他高職院校的同仁一道對(duì)生物制藥及相關(guān)專業(yè)的微生物課程教學(xué)改革進(jìn)行了一定的探索與實(shí)踐。
（一）優(yōu)化教學(xué)手段與方法
主要教學(xué)手段 合理利用學(xué)院優(yōu)越的教學(xué)條件是提高課程教學(xué)質(zhì)量的基本手段。在本課程教學(xué)中，我們充分利用學(xué)院完善的多媒體教學(xué)資源、電視顯微鏡設(shè)備組織教學(xué)，通過(guò)多媒體課件、視頻、標(biāo)本與即時(shí)的實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行形象、直觀的教學(xué)。同時(shí)，加強(qiáng)與本地區(qū)制藥企業(yè)的聯(lián)系，與企業(yè)一線生產(chǎn)人員共同探討課程教學(xué)內(nèi)容。
教學(xué)方法探索 在教學(xué)方法上，我們依據(jù)高職類學(xué)生文化基礎(chǔ)、思維特征，針對(duì)不同的具體內(nèi)容選擇采取了項(xiàng)目教學(xué)法及案例導(dǎo)入法等多種“教學(xué)做合一”的形式開(kāi)展教學(xué)，從而實(shí)現(xiàn)了將過(guò)去以教室為中心的學(xué)習(xí)形式向以實(shí)驗(yàn)室工作過(guò)程為中心和“邊教、邊學(xué)、邊做”形式的過(guò)渡。例如，將基礎(chǔ)知識(shí)部分組織成多個(gè)承前啟后的項(xiàng)目，微生物應(yīng)用部分（如微生物與發(fā)酵、食用菌栽培與藥品的微生物污染檢測(cè)等）采用案例法組織教學(xué)。通過(guò)啟發(fā)與討論、理論密切聯(lián)系實(shí)際等方法引導(dǎo)學(xué)生加深對(duì)所學(xué)知識(shí)的運(yùn)用、提高學(xué)習(xí)的興趣與積極性。提供適量學(xué)時(shí)，鼓勵(lì)有積極性的學(xué)生自選教學(xué)內(nèi)容，采取合作或獨(dú)立查閱資料和制作多媒體課件進(jìn)行授課的形式實(shí)現(xiàn)了師生主體角色的轉(zhuǎn)換，從而使學(xué)習(xí)以形成綜合能力為目的而非單純的知識(shí)攝取。同時(shí)鼓勵(lì)學(xué)生在實(shí)驗(yàn)教師的指導(dǎo)下，根據(jù)自身興趣進(jìn)行微生物實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)與操作。
在有了一定的手段與方法基礎(chǔ)上，我們認(rèn)為利用適當(dāng)?shù)挠哪蛴⑽牡冉虒W(xué)技巧也是提高教學(xué)效果的良策。比如在要求學(xué)生列舉已知的病毒時(shí)“特意提醒”不要自作聰明地制造“人瘟病毒”。在課堂中偶爾適時(shí)地穿插一個(gè)英語(yǔ)單詞或簡(jiǎn)單的句子能夠起到很好的調(diào)節(jié)作用，往往能讓喜歡或不喜歡英語(yǔ)的學(xué)生激發(fā)興趣。
（二）認(rèn)真整合教學(xué)內(nèi)容
內(nèi)容的選取與組織 2007年下半年，在長(zhǎng)期從事企業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐的“雙師型”教師共同參與下，我們編寫出了一本較為符合當(dāng)前高職教育理念的湖北省“十一五”規(guī)劃教材——《微生物及其應(yīng)用》并獲2009年湖北省高職高專優(yōu)秀規(guī)劃教材獎(jiǎng)。本教材根據(jù)當(dāng)前高職院校生物制藥專業(yè)的培養(yǎng)目標(biāo)及湖北省示范院校生物制藥專業(yè)人才培養(yǎng)方案建設(shè)要求建立課程教學(xué)標(biāo)準(zhǔn)與內(nèi)容，按照“教學(xué)做合一”模式進(jìn)行教學(xué)內(nèi)容的合理融合。在內(nèi)容的組織上充分考慮高職學(xué)生的文化基礎(chǔ)與思維習(xí)慣，適當(dāng)降低了理論知識(shí)部分的深度，強(qiáng)化了微生物在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用。將課程內(nèi)容按照微生物由大到小、由表及里的原則進(jìn)行重新組合，首先使學(xué)生通過(guò)顯微鏡對(duì)各種微生物進(jìn)行最基本的感性認(rèn)識(shí)，然后逐漸了解微生物的培養(yǎng)技術(shù)及其在生產(chǎn)中的應(yīng)用，從而順其自然地完成對(duì)整個(gè)微生物課程內(nèi)容由感知到認(rèn)知的知識(shí)延伸與拓展過(guò)程。
教學(xué)組織與實(shí)踐 為了較好地落實(shí)高職教育所推崇的“邊做邊學(xué)，邊學(xué)邊練”行動(dòng)導(dǎo)向的教學(xué)理念，我們采取的是理論與相應(yīng)實(shí)踐操作（單元實(shí)驗(yàn)）相互融合的模式開(kāi)展教學(xué)，并將教學(xué)內(nèi)容劃分為“基本知識(shí)與技能”和“知識(shí)與能力運(yùn)用”兩大模塊，其中包含了“微生物形態(tài)觀察技術(shù)”、“微生物分布與生長(zhǎng)控制技術(shù)”及“微生物應(yīng)用與檢測(cè)技術(shù)”三個(gè)單元與七個(gè)項(xiàng)目來(lái)實(shí)施教學(xué)。在此基礎(chǔ)上，我們還開(kāi)發(fā)了《微生物及其應(yīng)用》院級(jí)精品課，并在教學(xué)中認(rèn)真踐行“邊做邊學(xué)，邊學(xué)邊練”的教學(xué)方法，使學(xué)生能夠自覺(jué)地將所學(xué)知識(shí)與實(shí)踐相結(jié)合，從而既增強(qiáng)了學(xué)生學(xué)習(xí)的主動(dòng)性，同時(shí)又較好地鍛煉了他們的動(dòng)手能力，強(qiáng)化了教學(xué)效果。
重視第一次課設(shè)計(jì) 第一次課是一門課程的序曲，它是引導(dǎo)學(xué)生進(jìn)入微觀世界、激發(fā)學(xué)生求知欲望、增強(qiáng)課程魅力的最佳向?qū)?。本課程的第一次課是通過(guò)“一個(gè)富有創(chuàng)造和啟迪性的故事（列文虎克）”、“多幅彩色動(dòng)靜態(tài)圖片的展示”和“一系列驚人的數(shù)字”等具有鮮明特色和感性認(rèn)識(shí)的內(nèi)容逐步展開(kāi)的，非常強(qiáng)烈的視覺(jué)效果讓學(xué)生產(chǎn)生了對(duì)微生物的濃厚興趣，進(jìn)而較好地激發(fā)了他們對(duì)本課程的學(xué)習(xí)熱情和探究心理，當(dāng)然也取得了非常好的教學(xué)效果。
（三）強(qiáng)化實(shí)踐教學(xué)與考核
加大實(shí)踐教學(xué)比例 本課程的教學(xué)目的是為后續(xù)的職業(yè)技術(shù)課程學(xué)習(xí)與生產(chǎn)實(shí)踐打下良好基礎(chǔ)，滿足生物制藥生產(chǎn)、建設(shè)、管理和服務(wù)第一線的技術(shù)應(yīng)用型人才對(duì)微生物知識(shí)與技能的需要，同時(shí)培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新精神和創(chuàng)業(yè)能力。因此，我們按照“教學(xué)做合一”的模式將理論知識(shí)與有關(guān)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容進(jìn)行了有機(jī)融合，因而也在很大程度上減少了理論學(xué)時(shí)，相應(yīng)增加了實(shí)驗(yàn)操作學(xué)時(shí)，使理論與實(shí)踐學(xué)時(shí)之比將近1∶1。將課程的實(shí)驗(yàn)分為平時(shí)的單元實(shí)驗(yàn)、期末整周的綜合實(shí)訓(xùn)、培養(yǎng)興趣的自主實(shí)驗(yàn)（如對(duì)口腔、霉變水果中微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)等）幾項(xiàng)，并著重培養(yǎng)學(xué)生的無(wú)菌操作技能和微生物實(shí)驗(yàn)安全意識(shí)。
改革實(shí)踐考核制度 在對(duì)本課程教學(xué)模式進(jìn)行探索與實(shí)踐的同時(shí)，我們對(duì)其考試制度也進(jìn)行了改革。改變了傳統(tǒng)的以理論為主、實(shí)驗(yàn)為輔的考試為理論考試和實(shí)驗(yàn)操作考核并重的新型綜合考試制度。使實(shí)驗(yàn)成績(jī)與理論成績(jī)之比達(dá)到1∶1，其中實(shí)驗(yàn)考核以實(shí)踐操作為主，口試、筆試為輔。同時(shí)，堅(jiān)持平時(shí)表現(xiàn)與考試考核并舉的形式對(duì)學(xué)生進(jìn)行知識(shí)、能力和素質(zhì)等方面的綜合評(píng)價(jià)，即按照平時(shí)考勤、提問(wèn)和作業(yè)成績(jī)占總成績(jī)20％、理論考試和實(shí)驗(yàn)成績(jī)（包括實(shí)驗(yàn)操作考核、實(shí)驗(yàn)課表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)報(bào)告等）各占40％的分配比例進(jìn)行課程成績(jī)的綜合評(píng)定，從而使本課程的成績(jī)考核既符合高職以過(guò)程為導(dǎo)向的課程觀和以行動(dòng)為導(dǎo)向的教學(xué)觀，又實(shí)現(xiàn)了考試過(guò)程的全程化和考試手段的多元化；既增加了考試的靈活性，又調(diào)動(dòng)了學(xué)生實(shí)踐操作的積極性，取得了較好的教學(xué)效果。
在2008年和2009年由教育部高等學(xué)校高職高專生物技術(shù)類專業(yè)教學(xué)指導(dǎo)委員會(huì)組織的兩屆生物技能大賽活動(dòng)中（含微生物操作技能競(jìng)賽），我院生物制藥專業(yè)的學(xué)生分別獲得了團(tuán)體一等獎(jiǎng)一項(xiàng)、個(gè)人一等獎(jiǎng)二項(xiàng)、二等獎(jiǎng)和三等獎(jiǎng)各一項(xiàng)的好成績(jī)。
