時(shí)間：2023-03-20 16:21:59
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1.1一般資料
患者的入選是根據(jù)美國(guó)胸科協(xié)會(huì)制定的診斷指南，存在大于3周以上的咳嗽癥狀，有至少一條哮喘癥狀，并且體格檢查出現(xiàn)相應(yīng)體征的兒童患者隨機(jī)納入研究，研究時(shí)間從2012年1月～2014年6月。
1.2方法采用
流式細(xì)胞術(shù)。所收集樣本冷凍保存，統(tǒng)一檢測(cè)，末梢血樣采集于肝素鈉抗凝管中，取100μL血樣加入中含有20μL白介素-3的緩沖液中，室溫孵育10min，然后加入100μL兒童哮喘患者或健康對(duì)照組的血清，室溫孵育20min，其中緩沖液包含0.12MNaCI，0.005MKCI，0.025MTris，pH7.6。N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLP0.4mmol/L）（Sigma-Aldrich公司，圣路易，MO，USA），一種非特異性細(xì)胞活化劑，被用于陽性對(duì)照，洗滌緩沖液（0.01M磷酸緩沖鹽水包括0.01M的磷酸二氫鈉，0.01M磷酸氫二鈉，pH為7.2～7.4）被用于陰性對(duì)照。孵育結(jié)束后將樣品置于冷卻的冰上防止嗜堿性粒細(xì)胞活化和降解，繼而與熒光FITC結(jié)合的抗CD63抗體孵育BectonDickinson，F(xiàn)ranklinLakes，NJ，USA），與熒光PE結(jié)合的抗IgE抗體（Pharmacia，Uppsala，Sweden），以及PerCP結(jié)合的抗CD45抗體（BectonDickinson）避光孵育20min，加入紅細(xì)胞溶解液。2500rpm離心10min，將沉淀用緩沖液懸浮，BDFACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。在采集過程中，紅色熒光（FL2）和前向散射（FSC）和側(cè)向角散射（SSC）的特點(diǎn)是采用至少1000嗜堿性粒細(xì)胞的表達(dá)高IgE介導(dǎo)的面密度的選框進(jìn)行分析，使用FSC/SSC特性淋巴細(xì)胞的定義。然后，從這些細(xì)胞，F(xiàn)L3/FL2圖上嗜堿性粒細(xì)胞的認(rèn)定為CD45低/IgE的高表達(dá)。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
使用SPSS®軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（SPSS公司，芝加哥，IL，美國(guó)）。x2檢驗(yàn)用于比較患者組和對(duì)照組之間各個(gè)受體的表達(dá)情況。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2結(jié)果
共納入研究的哮喘兒童有72名，健康對(duì)照組32例。嗜堿性粒細(xì)胞的識(shí)別依賴表面受體的CD45的低表達(dá)和IgE的高表達(dá)，CD63的表達(dá)可用于識(shí)別嗜堿性粒細(xì)胞是否被患者或者健康對(duì)照組的血清激活。接受來自非過敏的健康志愿者的血清刺激后，抗FcεRI的自身抗體CD63的表達(dá)數(shù)目和比例如表1所示。29/78（37.2％）的哮喘患者血清表達(dá)CD63+的嗜堿性粒細(xì)胞，CD63+嗜堿性粒細(xì)胞的人數(shù)比例是為（36.9±8.3）％。與此相反，在健康組中的血清只有4/32（12.5％）對(duì)照表明CD63+嗜堿性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的“x±s”的比例人口，這是CD63+為（26.3±5.6）％。哮喘中的比重差患者與健康的比例。有CD63+嗜堿性粒細(xì)胞的對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
3討論
1、挑選本院2010年6月至2012年12月送檢病理科支氣管鏡刷檢細(xì)胞學(xué)標(biāo)本252例。所有的患者最后均確診為肺癌。男184例，女68例，年齡44～85歲，(平均66．3歲)。所有的患者行支氣管鏡刷檢，同時(shí)薄層液基細(xì)胞學(xué)涂片與傳統(tǒng)涂片。
2、儀器:美國(guó)SurPathTMPrepstain全自動(dòng)液基薄層細(xì)胞制片染片機(jī)(BDTriPath，BurlingtonNC，USA)及相關(guān)耗材。采用奧林巴斯電子支氣管鏡(BF-260或1T260工作鏡)進(jìn)行檢查。鏡下發(fā)現(xiàn)肺癌的直接征象或間接征象者，根據(jù)胸部CT提示的病變行透視下支氣管鏡肺活檢。所有患者均在活檢部位采用南京微創(chuàng)一次性保護(hù)型細(xì)胞刷刷檢，將毛刷頭直接在玻片上常規(guī)涂片1張。再將毛刷頭置于盛有10mlCyteRichRed固定液的50ml離心管中充分震蕩漂洗收集細(xì)胞。
3、制片方法
3.1傳統(tǒng)涂片方法:纖維支氣管鏡刷頭直接涂抹于載玻片上，涂片1張，干燥，95%乙醇固定10min，常規(guī)HE染色鏡檢。
3.2BDTriPath制片方法:標(biāo)本加入專用50ml離心管中，使用程控離心機(jī)以Hettich3#程序600r/min離心10min，迅速管架倒置180°傾出上清液，加入CyteRichRed固定液20ml，靜置30min，Hettich的3#程序以600r/min離心10min，迅速管架倒置180°傾出上清液，渦漩混合器振蕩均勻，加入10mlTris緩沖液，混均，移至12ml的離心管，Hettich的4#程序以600r/min離心5min，迅速管架倒置180°傾出上清液，渦漩混合器振蕩(15±5)s。管架放在PrePStain系統(tǒng)上，靜置10min，等待上機(jī)自動(dòng)制片染色。
4、判斷標(biāo)準(zhǔn):涂片診斷采用正常、可疑癌細(xì)胞、癌細(xì)胞三種分類方法，后兩項(xiàng)為陽性標(biāo)本。盡量由同一位醫(yī)師操作電子支氣管鏡采集標(biāo)本，由兩位細(xì)胞病理學(xué)醫(yī)師同時(shí)閱片鏡檢，以找到癌細(xì)胞為陽性。
5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)采用SPSS10．0軟件包進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
二、結(jié)果
兩種涂片質(zhì)量比較:傳統(tǒng)涂片，涂片范圍大小不一，涂片背景紅細(xì)胞白細(xì)胞多，細(xì)胞分布厚薄不均，胞質(zhì)核漿結(jié)構(gòu)對(duì)比不明顯，胞核染色質(zhì)均一模糊、核仁不清;支氣管鏡刷檢細(xì)胞標(biāo)本LCT制片后，細(xì)胞集中于涂片范圍直徑15mm專用玻片上，細(xì)胞界限清楚，涂片背景干凈清晰，細(xì)胞分布單個(gè)散在或成團(tuán)分布，有立體感，胞質(zhì)著色鮮艷、易于觀察，胞核核膜分明，核內(nèi)染色質(zhì)及核仁清晰可見。薄層液基細(xì)胞學(xué)涂片診斷肺癌陽性率為58．33%，(146/252)，其中中央型肺癌98例，周圍型肺癌48例。傳統(tǒng)涂片診斷肺癌的陽率為33．19%，(84/252)，其中中央型肺癌68例，周圍型肺癌16例。液基薄層細(xì)胞學(xué)與傳統(tǒng)涂片的陽性率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0．05。
三、討論
支氣管鏡刷檢細(xì)胞學(xué)標(biāo)本應(yīng)用傳統(tǒng)涂片方法制片，受細(xì)胞新鮮程度、細(xì)胞量、出血及炎性背景、制片技術(shù)等因素影響，造成背景不清晰、涂片細(xì)胞易重疊、厚薄不均、細(xì)胞形態(tài)不易觀察、有意義細(xì)胞數(shù)量偏少，容易出現(xiàn)假陰性或假陽性結(jié)果，漏診重要病變。液基薄層細(xì)胞學(xué)制片技術(shù)(LCT)是近年來出現(xiàn)一種制片技術(shù)的革新，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)巴氏涂片的檢查方法，其中有代表性的是BDThiPth離心沉降技術(shù)和新柏氏(ThiPthTCT)模式技術(shù)。兩種方法工作原理不同，分別為重力沉降式和過濾膜式，已經(jīng)廣泛成熟應(yīng)用于宮頸細(xì)胞學(xué)檢查和TBS診斷報(bào)告，對(duì)比傳統(tǒng)巴氏涂片，宮頸癌及癌前病變(低度鱗狀上皮內(nèi)病變和高度鱗狀上皮內(nèi)病變)檢出率大大提高，標(biāo)本采集及制片質(zhì)量的優(yōu)越性是傳統(tǒng)涂片技術(shù)無法比擬的，特別是BDThiPth制片技術(shù)在細(xì)胞數(shù)量、背景去除非診斷性雜質(zhì)、全自動(dòng)制片染色及診斷質(zhì)量尤為突出。美國(guó)FDA認(rèn)證:超柏式液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查是所有液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)中檢出率最高的技術(shù)。2005年美國(guó)病理協(xié)會(huì)非婦科細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室比較液基制片方法與傳統(tǒng)制片方法在體液樣本檢測(cè)能力，證實(shí)液基制片方法更容易檢出腫瘤。
對(duì)比傳統(tǒng)涂片，LCT制片使細(xì)胞在載玻片上分布均勻，厚薄一致，細(xì)胞數(shù)量多，集中于15mm范圍內(nèi)易于閱片，核染色質(zhì)著色鮮明，核漿對(duì)比效果好，易于觀察核結(jié)構(gòu)，染色背景清晰，制片質(zhì)量十分滿意，陽性率顯著提高。LCT制片技術(shù)和診斷質(zhì)量體會(huì):支氣管鏡刷檢由于全部收集或大部分收集送檢標(biāo)本，最大程度保留病變細(xì)胞，尤為適用LCT制片方法;液基涂片中的細(xì)胞核可能不如傳統(tǒng)涂片中那樣深染，但細(xì)胞核異型性是判讀惡性或可疑惡性病變的重要重要標(biāo)準(zhǔn)，一般認(rèn)為核占優(yōu)勢(shì)、核漿比例高、核膜不規(guī)則、染色質(zhì)凝塊狀、核仁清或多個(gè)小核仁為惡性證據(jù);巴氏染色胞漿在區(qū)分腺癌或分化鱗癌很有幫助，前者胞漿見空泡，后者胞漿橘黃色、含角蛋白;仔細(xì)觀察成團(tuán)核深染的細(xì)胞，如懷疑異常，在背景中全面尋找單個(gè)異型細(xì)胞更有意義;提高制片質(zhì)量顯著，但診斷陽性率的改善還需病理診斷醫(yī)師勤于積累，LCT在支氣管鏡刷檢細(xì)胞標(biāo)本應(yīng)用時(shí)間及應(yīng)用范圍還比較晚，對(duì)同一份標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行普通涂片，以積累經(jīng)驗(yàn)，減少誤診。
支氣管鏡檢查是目前診斷肺癌的常規(guī)檢查方法，刷檢聯(lián)合組織活檢的重要手段。傳統(tǒng)支氣管鏡黏膜細(xì)胞學(xué)檢查是在支氣管鏡檢查過程中用支氣管毛刷直接在普通玻片上涂片，診斷率低。LCT對(duì)肺癌有更高的診斷率。國(guó)內(nèi)也有少量文獻(xiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過與組織病理學(xué)對(duì)照，普通涂片法檢出敏感度為33．19%，而LCT檢出敏感度為58．33%，較普通涂片法提高了25．14%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
四、總結(jié)
1.1金屬元素
有研究發(fā)現(xiàn)，某些重金屬，比如錳的慢性中毒可損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，特別是紋狀體和蒼白球等部位，產(chǎn)生類似PD的錐體外系神經(jīng)功能障礙。Guilarte等及Huang的研究也發(fā)現(xiàn)錳中毒與PD有著密切的聯(lián)系。Park發(fā)現(xiàn)電焊工及其他長(zhǎng)期暴露于錳的工人存在著出現(xiàn)神經(jīng)癥狀和罹患PD的危險(xiǎn)性。Moberly等的研究還表明，錳可以通過作用于嗅球和基底神經(jīng)節(jié)的多巴胺能神經(jīng)元來影響神經(jīng)介質(zhì)的釋放，從而導(dǎo)致PD等錐體外系疾病的發(fā)生。Coon等利用K-XRF技術(shù)測(cè)量了慢性暴露條件下鉛在人體內(nèi)的沉積量，并表明長(zhǎng)期的鉛暴露與PD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)成正相關(guān)。Komatsu等證實(shí)了錳、鐵、鉛、鎘、鋁等金屬在體內(nèi)的沉積會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激的增加，從而引起PD的發(fā)生。
1.2農(nóng)藥百草枯
對(duì)多巴胺系統(tǒng)具有神經(jīng)毒性作用，從而導(dǎo)致PD樣癥狀和改變。Betarbet等利用魚藤酮復(fù)制出了類似PD的大鼠模型，其癥狀包括出現(xiàn)震顫、步態(tài)不穩(wěn)等。某些PD患者的腦組織中所含有機(jī)氯農(nóng)藥，如林丹、狄氏劑的水平明顯高于對(duì)照組。代森錳（一種殺真菌劑）也被報(bào)道與PD的發(fā)生相關(guān)。還有研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)磷農(nóng)藥同樣與PD的發(fā)病相關(guān)。
1.3環(huán)境毒素
1983年，美國(guó)有人吸食了含有1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）的海洛因后出現(xiàn)了典型的PD癥狀和病理學(xué)改變，研究者受到啟發(fā)用靈長(zhǎng)類復(fù)制了MPTP的PD動(dòng)物模型。研究人員經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MPTP對(duì)多巴胺能系統(tǒng)具有神經(jīng)毒性從而導(dǎo)致PD樣癥狀和改變。此后，MPTP的PD模型開始被應(yīng)用于試驗(yàn)中。另外，Shepherd等發(fā)現(xiàn)，MPTP還可明顯增強(qiáng)百草枯對(duì)多巴胺能系統(tǒng)的損害。
1.4其他因素
PD的發(fā)病還與很多種因素相關(guān)。有學(xué)者經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，攝入過多的脂肪，罹患PD的概率也會(huì)增加。Miyake等發(fā)現(xiàn)攝入花生四烯酸和膽固醇會(huì)增加PD的發(fā)生概率。Kyrozis等通過對(duì)希臘人飲食習(xí)慣的研究發(fā)現(xiàn)飲用牛奶也和PD發(fā)病有關(guān)。Kotagal等發(fā)現(xiàn)高血壓等心血管危險(xiǎn)因素與PD發(fā)生具有一定相關(guān)性。Aryal等還發(fā)現(xiàn)，四氫生物蝶呤（BH4）等增加會(huì)導(dǎo)致PD初期病情的惡化。Willis等發(fā)現(xiàn)居住環(huán)境與PD的發(fā)生也有一定關(guān)系。
2PD發(fā)病機(jī)制的研究手段及應(yīng)用進(jìn)展
2.1概況
當(dāng)前的PD研究手段包括動(dòng)物模型，細(xì)胞模型和iPScs模型等。動(dòng)物模型為PD發(fā)病機(jī)制最早的研究方式。Maneuf等早在20世紀(jì)50年代就通過對(duì)嚙齒類動(dòng)物注射利血平的方法使其產(chǎn)生類似人類的PD樣癥狀。此后研究者們又相繼積極研發(fā)出了6-羥多巴胺模型，百草枯模型等?；蚯贸娃D(zhuǎn)基因小鼠模型在PD研究中也有應(yīng)用。細(xì)胞模型包括腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞系（pheochromocytomacells，PC12）細(xì)胞模型，SH-SY5Y細(xì)胞模型等。大腦結(jié)構(gòu)復(fù)雜性的缺乏和較短的模型壽命意味著小鼠等動(dòng)物模型難以詳盡地闡釋人類的疾病，細(xì)胞模型也并沒有可靠地顯示出在PD患者身上所觀察到的緩慢的疾病進(jìn)程。近幾年，新興的iPScs技術(shù)，將來源于PD病人的iPScs可分化為中腦多巴胺能神經(jīng)元，在體外模擬其生理特性，可方便研究人員在更接近人體內(nèi)環(huán)境的條件下研究PD的發(fā)病機(jī)制。
2.2iPScs技術(shù)的發(fā)展
iPScs技術(shù)是干細(xì)胞領(lǐng)域近幾年來比較熱門的一種新興干細(xì)胞技術(shù)。該技術(shù)通過病毒載體或其他特異載體將特定轉(zhuǎn)錄因子的組合轉(zhuǎn)入到被誘導(dǎo)細(xì)胞中，進(jìn)而將已分化的體細(xì)胞重編程為未分化的多能細(xì)胞。2006年Takahashi成功將小鼠成纖維細(xì)胞重編程為與胚胎干細(xì)胞特征相似的誘導(dǎo)性胚胎干細(xì)胞，即iPScs。他利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將4個(gè)與多能性相關(guān)的基因Oct-4、Sox2、Klf4、c-Myc組合導(dǎo)入被誘導(dǎo)細(xì)胞，再經(jīng)過多能性分子Fbxl5篩選，從而得到在多方面與胚胎干細(xì)胞很相似的多能性細(xì)胞。隨后成功誘導(dǎo)出iPScs。2008年Nakagawa研究小組使用了Oct3/4、Sox2、Klf43個(gè)基因，避免了原癌基因c-Myc的插入使得iPScs更安全化，利用Nanog代替Fbx15作為篩選標(biāo)記，從而進(jìn)一步提高了篩選的特異性。2009年，Woltjen研究小組以轉(zhuǎn)位子為載體代替了逆轉(zhuǎn)錄病毒，所得到的iPScs避免了病毒基因的頑固表達(dá)和插入突變等風(fēng)險(xiǎn)，從而使得臨床應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)一步大大降低。另外，直接將重組蛋白質(zhì)導(dǎo)入體細(xì)胞以及利用合成mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染等方法也顯著降低了突變的危險(xiǎn)性。有報(bào)道稱體細(xì)胞可以通過小分子復(fù)合物而不依靠病毒來實(shí)現(xiàn)重編程。還有研究者發(fā)現(xiàn)毛猴素，二甲基五羥色胺和D4476可作為Oct3/4的化學(xué)替代品。隨著研究的深入，iPScs技術(shù)愈加成熟，不斷進(jìn)展的誘導(dǎo)iPScs的方法既可有效消除重編程造成的種種潛在危險(xiǎn)，又可以簡(jiǎn)單快速地獲得iPScs。
2.3利用iPScs技術(shù)進(jìn)行環(huán)境、職業(yè)致病因素
誘導(dǎo)PD發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究由于環(huán)境因素和遺傳因素相互影響的復(fù)雜性，環(huán)境職業(yè)因素對(duì)PD作用相關(guān)的研究具有一定難度。Aboud等以無PD遺傳危險(xiǎn)因素者為對(duì)照組，以PARK2等位基因功能缺失且具有PD家族史但是還未出現(xiàn)癥狀者為實(shí)驗(yàn)組建立了觀察錳神經(jīng)毒性差異的iPScs模型。來源于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的真皮成纖維細(xì)胞的iPScs被分別誘導(dǎo)分化為早期神經(jīng)神經(jīng)前體細(xì)胞。經(jīng)過測(cè)定發(fā)現(xiàn)兩組神經(jīng)前體細(xì)胞在對(duì)錳毒性的敏感性和線粒體分裂等方面幾乎沒有差別，但是實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，活性氧顯著升高。經(jīng)過測(cè)定發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，錳在細(xì)胞內(nèi)的沉積明顯減少，表明在錳沉積率相同的條件下實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)前體細(xì)胞對(duì)于錳毒性的敏感性比對(duì)照組高。但是錳沉積明顯減少的原因是否與PARK2突變有關(guān)尚不清楚。Kikuchi等將人體iPScs來源的的神經(jīng)前體細(xì)胞在無血清、無飼養(yǎng)層條件下培養(yǎng)至28d和42d后分別定向性植入MPTP處理過的猴子雙側(cè)豆?fàn)詈耍踩?個(gè)月后。磁共振成像（MRI）圖像顯示移植的細(xì)胞在猴子的大腦中存活增殖。由于MRI圖像與猴子腦片蘇木精-伊紅染色的結(jié)果具有一致性，他們利用MRI來觀察移植細(xì)胞的增殖情況。培養(yǎng)至28d的移植細(xì)胞增殖迅速，而培養(yǎng)至42d的移植細(xì)胞增殖相對(duì)緩慢。他們還發(fā)現(xiàn)移植后1~3個(gè)月的細(xì)胞倍增時(shí)間明顯短于3~6個(gè)月，說明細(xì)胞的增殖能力在后期開始下降，但至少可以在猴腦內(nèi)存活6個(gè)月以上。他們又通過描述行為評(píng)定量表發(fā)現(xiàn)移植后猴子的行為較之前發(fā)生了一些進(jìn)步，表明人體iPScs在未來臨床試驗(yàn)中的治療潛力。Deleidi等通過逆轉(zhuǎn)錄病毒將人類KLF4，SOX2，OCT4和c-MYC導(dǎo)入恒河猴皮膚成纖維細(xì)胞，獲得iPScs后進(jìn)一步將其誘導(dǎo)為多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞并植入6-羥基多巴胺（6-OHDA）誘導(dǎo)的小鼠PD模型的紋狀體，移植細(xì)胞在移植16周后進(jìn)行組織分析發(fā)現(xiàn)具有酪氨酸羥化酶陽性細(xì)胞，且小鼠的紋狀體中顯示出神經(jīng)的再生現(xiàn)象。他們還發(fā)現(xiàn)這些動(dòng)物的同側(cè)旋轉(zhuǎn)行為等在移植后均有所恢復(fù)，而且移植6個(gè)月后這些小鼠既沒有產(chǎn)生腫瘤，也沒有發(fā)生炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了iPScs在PD等神經(jīng)退行性疾病在臨床治療方面的安全性。Chang等的研究證實(shí)了二十二碳六烯酸處理過的iPScs來源的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞植入到6-OHDA誘導(dǎo)的小鼠PD模型體內(nèi)，小鼠的癥狀在4個(gè)月后得到了一定的緩解。Peng等將來源于iPScs的神經(jīng)多巴胺能神經(jīng)元建立起1-甲基4-苯基吡啶離子（MPP+）模型和魚藤酮的PD體外模型，對(duì)44種可能對(duì)PD有治療作用的藥物進(jìn)行了兩輪篩選，并利用具有神經(jīng)保護(hù)作用的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子作為陽性對(duì)照。經(jīng)過MPP+的初篩和確認(rèn)篩檢，他們發(fā)現(xiàn)其中16種藥物對(duì)于MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡顯示出神經(jīng)保護(hù)作用，并利用MPP+模型建立起了這16種藥物的劑量反應(yīng)曲線。經(jīng)過魚藤酮模型的篩檢他們更加明確了這些藥物對(duì)于魚藤酮誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元凋亡確實(shí)具有一定的保護(hù)作用。這種方法可以應(yīng)用于可能具有臨床療效的PD藥物的檢測(cè)來縮短藥物進(jìn)入臨床的時(shí)間，并可增加臨床實(shí)驗(yàn)成功的可能性和個(gè)體化治療的可能性，為明確藥物療效提供了良好的平臺(tái)。
2.4iPScs技術(shù)
1實(shí)驗(yàn)對(duì)象及樣品制備本實(shí)驗(yàn)對(duì)象為半年內(nèi)未接受過輸血的健康中國(guó)人12名，抽取靜脈血5ml，使用ABO血型檢測(cè)試劑檢測(cè)其ABO血型。其中A型血2人，B型血6人，O型血3人，AB型血1人，RhD血型均為陽性。樣品制備人員將A、B、O血型相同且測(cè)定的8種血型抗原至少有2種不相同的單一血樣制備成體外混合血樣?；旌涎獦右罁?jù)紅細(xì)胞數(shù)按一定比例混合，混合比例分別為95％／5％、97％／3％、98．5％／1．5％、99．5％／0．5％，各比例混合血樣的例數(shù)分別為8例，8例，8例，10例。樣品制備人員將所有單一和混合血樣編號(hào)后發(fā)放給檢測(cè)人員進(jìn)行檢測(cè)分析。
2儀器和試劑本實(shí)驗(yàn)所用檢測(cè)儀器為美國(guó)BeckmanCoulter公司生產(chǎn)的FC500型號(hào)流式細(xì)胞儀。使用抗體為瑞士DiaMed公司生產(chǎn)的單克隆抗體產(chǎn)品，以及SEROTEC公司生產(chǎn)的FITC熒光標(biāo)記的羊抗人免疫球蛋白。
3實(shí)驗(yàn)方法用細(xì)胞穩(wěn)定液將EDTA抗凝的新鮮血稀釋后，加入單克隆抗體，使之與相應(yīng)的紅細(xì)胞表面抗原結(jié)合，并用熒光素標(biāo)記的示蹤抗體標(biāo)記紅細(xì)胞表面抗原抗體復(fù)合物。使用流式細(xì)胞儀對(duì)紅細(xì)胞表面特定血型抗原的表達(dá)情況進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。通過對(duì)此方法檢測(cè)的特異性和靈敏度、信噪比和污染攜帶率、檢測(cè)樣品穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性等方面的檢測(cè)，驗(yàn)證流式細(xì)胞儀檢測(cè)異體血液回輸方法的準(zhǔn)確性和可操作性。
二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1抗原檢測(cè)特異性和靈敏度經(jīng)檢測(cè)，這46例血樣的檢測(cè)判定結(jié)果為：12例單一血樣全部被檢出單峰并被準(zhǔn)確判為陰性。8例95％／5％和8例97％／3％比例混合的血樣均被檢測(cè)出兩個(gè)以上雙峰，所有應(yīng)為混合雙峰的樣品均被準(zhǔn)確檢出；8例98．5％／1．5％比例混合的血樣在應(yīng)出現(xiàn)雙峰的樣品圖中能被識(shí)別為雙峰，但個(gè)別抗體雙峰分離效果不佳，需進(jìn)行抗體優(yōu)化程序后方能被判定為雙峰；10例99．5％／0．5％比例混合的血樣中，只有4例樣品被判斷為含2個(gè)以上雙峰，其他混合樣品由于混合比例低于抗體檢測(cè)限而無法判定。
2儀器信噪比和污染攜帶率
2.1儀器信噪比以8種抗體在95％／5％混合紅細(xì)胞樣品中只加入熒光示蹤抗體時(shí)，表達(dá)區(qū)域的紅細(xì)胞數(shù)占已設(shè)定的紅細(xì)胞區(qū)域內(nèi)細(xì)胞總數(shù)的百分比作為噪音，以3倍噪音作為該抗體的檢測(cè)限
2.2污染攜帶率根據(jù)流式細(xì)胞儀檢驗(yàn)要求，在完成一次樣品檢測(cè)后立即檢測(cè)一支純水空白管，記錄30s內(nèi)紅細(xì)胞設(shè)定區(qū)域內(nèi)檢測(cè)到的顆粒數(shù)（N），重復(fù)200次，將檢測(cè)到的顆粒數(shù)相加，用此數(shù)值除以紅細(xì)胞設(shè)定區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞收集總數(shù)（A），并與重復(fù)次數(shù)作比，乘以100％得到污染攜帶率（CR）。公式為：CR＝（N1＋N2＋…＋N200）／（A×200）＝108／（50000×200）＝0．001％。計(jì)算所得結(jié)果符合儀器廠商推薦的污染攜帶率小于1％的要求，說明儀器連續(xù)進(jìn)樣檢測(cè)不同樣品不會(huì)因進(jìn)樣器污染而導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。
2.3樣品穩(wěn)定性在8例97％／3％混合的血樣和12例單一血樣中分別任意挑選1例，分別分裝在4個(gè)離心管中，冰箱4℃保存。在制備血樣的第1、5、14、28天分別對(duì)這兩例血樣進(jìn)行血型抗原檢測(cè)，測(cè)定血液樣品隨時(shí)間變化的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，經(jīng)過4周的冷藏存放，混合和單一血樣圖的鋒形及相對(duì)位置無顯著變化，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定。
2.4操作穩(wěn)定性在46例血樣中選出6個(gè)樣品，其中包含單一血樣和各比例混合血樣。將其分裝成3份，分別由3位檢測(cè)人員完成對(duì)血型抗原的檢測(cè)，驗(yàn)證不同操作者對(duì)檢測(cè)結(jié)果判定的一致性。結(jié)果顯示，3位檢測(cè)人員的檢測(cè)及判斷結(jié)果一致。
三、討論
1方法驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的血型血清學(xué)方法對(duì)46例血樣進(jìn)行紅細(xì)胞血型抗原的檢測(cè)，其中，12例單一血樣的特異性驗(yàn)證結(jié)果全部為陰性，符合世界反興奮劑機(jī)構(gòu)關(guān)于興奮劑檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)滿足100％陰性率和0％的假陽性率的特異性要求。對(duì)方法靈敏度的驗(yàn)證結(jié)果顯示，3％及以上比例少量混合的紅細(xì)胞被檢出率達(dá)到100％。當(dāng)少量混合的紅細(xì)胞比例降低時(shí)，部分樣品某些抗原表達(dá)與非表達(dá)的紅細(xì)胞群分離效果不好，出現(xiàn)融合峰或拖尾峰影響判斷，此時(shí)進(jìn)行抗體優(yōu)化程序可以解決或改善峰形問題。而當(dāng)混合比例進(jìn)一步降低至0．5％少量混合時(shí)，除了峰形問題外，由于定量結(jié)果低于抗體檢測(cè)限而使混合血樣檢出率明顯降低。造成這一結(jié)果的原因可能有：1）紅細(xì)胞血型抗原密度和抗原性強(qiáng)弱不同，導(dǎo)致其與抗體結(jié)合能力存在差異；2）每種抗體效價(jià)不同，檢測(cè)限也有高低，其檢出能力由檢測(cè)限值最高的抗體決定；3）這8種抗體分別為單克隆抗體IgM和IgG，由于抗體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，結(jié)合了IgM抗體的紅細(xì)胞更易聚集，造成單細(xì)胞懸液制備不完全，聚集的多細(xì)胞被檢測(cè)為單細(xì)胞，導(dǎo)致定量結(jié)果低于檢測(cè)限，因此，盡管有的檢測(cè)人員能夠從柱狀圖上觀察到微弱的雙峰，但由于測(cè)定到的混合比例低于檢測(cè)限而不能將其判定為陽性。此外，流式細(xì)胞儀狀態(tài)也會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響，導(dǎo)致少量混合的紅細(xì)胞信號(hào)無法被檢測(cè)人員識(shí)別。噪音和污染攜帶率影響了流式細(xì)胞儀的檢測(cè)能力，通過每次上機(jī)檢測(cè)前對(duì)儀器的校正以及對(duì)噪音和污染攜帶率的計(jì)算，來評(píng)估儀器狀態(tài)。儀器噪音過大，會(huì)掩蓋微弱的雙峰信號(hào)，導(dǎo)致假陰性結(jié)果的判定，而污染攜帶率過高則可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果。因此，在檢測(cè)過程中對(duì)儀器狀態(tài)的確認(rèn)是必要的。定期的維護(hù)和保養(yǎng)可以減少儀器本身對(duì)結(jié)果的影響。人體血量約為4～5L，其中，循環(huán)血量約占總血量的4／5。有研究顯示，循環(huán)系統(tǒng)血紅蛋白增加5％可以提高運(yùn)動(dòng)能力，輸血量太少則達(dá)不到增加血紅蛋白量進(jìn)而提高有氧耐力的目的。由于異體輸血伴隨感染、溶血、血液粘稠、疾病傳播等高風(fēng)險(xiǎn)因素，采用極少量輸入多個(gè)供血者血液的可能性較小，因而，此方法的檢測(cè)靈敏度能夠滿足興奮劑檢測(cè)的需要。通常紅細(xì)胞在人體內(nèi)的壽命約120天，這意味著，在異體輸血后，理論上最多可以有長(zhǎng)達(dá)3至4個(gè)月的檢測(cè)窗口期能夠檢測(cè)到異體血液回輸。相比傳統(tǒng)興奮劑只有幾天的檢測(cè)窗口期來說，該方法能夠大大提高興奮劑檢查的效率。用細(xì)胞穩(wěn)定液稀釋的混合血樣在冷藏條件下至少可存放4周，以此模擬運(yùn)動(dòng)員進(jìn)行異體輸血后一段時(shí)間體內(nèi)不同紅細(xì)胞群的比例關(guān)系。在4周內(nèi)，不同操作人員對(duì)相同樣品測(cè)得的混合紅細(xì)胞群比例無明顯變化，說明此方法穩(wěn)定性好，可操作性高。
2陽性判定根據(jù)世界反興奮劑機(jī)構(gòu)（WADA）對(duì)于免疫抗原法檢測(cè)興奮劑的要求，異體血液回輸陽性判定的標(biāo)準(zhǔn)為：在1份血樣中，當(dāng)有2個(gè)或2個(gè)以上特定紅細(xì)胞抗原存在多于1種表型時(shí)，判定為異體血液回輸陽性（AAF）；當(dāng)只有1個(gè)特定紅細(xì)胞抗原存在多于1種表型時(shí)，判定為可疑（ATF）。正常情況下，每個(gè)人體內(nèi)所有紅細(xì)胞抗原的表達(dá)是唯一的，即要么表達(dá)，要么不表達(dá)，當(dāng)體內(nèi)某種紅細(xì)胞抗原同時(shí)存在表達(dá)與不表達(dá)的情況時(shí)，即存在兩種不同的紅細(xì)胞群，提示有異體輸血。當(dāng)然上述判定還需要排除嵌合體血型情況。嵌合體血型多發(fā)生在異型輸血、異卵雙生、雙精受精和異型骨髓移植后。異型輸血、異型骨髓移植屬于獲得性嵌合（人工嵌合），異卵雙生、雙精受精是遺傳嵌合，屬于先天性嵌合。先天性嵌合，指在胚胎或妊娠時(shí)期形成的嵌合。先天性嵌合分兩種情況，一種是由于妊娠早期異卵雙生子之間存在血管交叉吻合，一方的造血干細(xì)胞經(jīng)由吻合的血管通路進(jìn)入到另一方體內(nèi)，在獲得性免疫耐受的基礎(chǔ)上，不同來源的造血干細(xì)胞分別產(chǎn)生兩群不同表型的紅細(xì)胞。另一種是在受精過程中，由2個(gè)卵細(xì)胞和2個(gè)相互結(jié)合而產(chǎn)生四倍體，四倍體受精卵繼續(xù)分裂就可能產(chǎn)生多種不同來源的細(xì)胞系。嵌合體現(xiàn)象會(huì)導(dǎo)致血型遺傳不符合經(jīng)典遺傳規(guī)律。此外，某些疾病也會(huì)導(dǎo)致嵌合體現(xiàn)象。因此在采用本方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)異體血液回輸陽性時(shí)，運(yùn)動(dòng)員需進(jìn)行嵌合體血型鑒定，以排除先天性嵌合情況。
3紅細(xì)胞血型抗原血型是血液系統(tǒng)的一種遺傳多態(tài)性。傳統(tǒng)的血型概念指的就是紅細(xì)胞血型，是指能以抗體來分類的紅細(xì)胞抗原表型。紅細(xì)胞血型抗原是紅細(xì)胞表面的化學(xué)構(gòu)型，其形成的物質(zhì)基礎(chǔ)是紅細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)及結(jié)合到脂質(zhì)和蛋白質(zhì)上的糖分子。根據(jù)生化特性不同，紅細(xì)胞血型抗原可分為兩類，一類是由糖分子結(jié)構(gòu)決定的血型抗原，如ABO、Hh，Lewis，P，I等血型；另一類是由蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)決定的血型抗原，如Rh，MNS，Kell，Kidd，JK等血型。人類血型抗原由血型基因決定，同時(shí)受調(diào)控基因或修飾基因控制，具有個(gè)體差異性和種族差異性。WADA對(duì)于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)異體血液回輸?shù)姆椒ㄖ猩婕暗降募t細(xì)胞血型抗原的選擇未做明確規(guī)定，一般以紅細(xì)胞血型抗原表型在人群中表達(dá)的比例作為選擇依據(jù)，在人群中表達(dá)型和不表達(dá)型均占有一定比例的血型抗原可作為候選抗原。表3列出了不同研究、賽事及機(jī)構(gòu)選擇的血型抗原種類和數(shù)量?？梢钥闯?，盡管各研究根據(jù)人群表達(dá)情況不同，選擇的血型抗原有所差異，但是都包括本文研究的這8種基本的血型抗原。本研究選擇了8種公認(rèn)的在人群中有適當(dāng)比例分布的血型抗原進(jìn)行中國(guó)人樣本的檢測(cè)分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，受試的11名中國(guó)人中最多有3人存在ABO血型及其他8種血型抗原表型完全一致的情況。換句話說，假如這3個(gè)人相互之間進(jìn)行異體輸血，且排除了紅細(xì)胞血型抗原密度的個(gè)體差異時(shí)，將不能被檢測(cè)為陽性。理想狀態(tài)下，能夠檢測(cè)的候選紅細(xì)胞血型抗原種類越多，檢測(cè)的假陰性率就越低，但對(duì)于大樣本量的實(shí)際興奮劑檢測(cè)工作來說，可操作性較差。因此，科學(xué)地選擇紅細(xì)胞抗原種類進(jìn)行檢測(cè)，可以有效提高興奮劑檢測(cè)效率。李晟瑋對(duì)Rh、Kell、Duffy、Kidd、Lewis、P、MNS和Luth等系統(tǒng)中的21個(gè)候選血型抗原進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中Leb、E、Jka、Jkb、M、C、e、c等血型抗原更適合于檢測(cè)中國(guó)人群異體血液回輸，并發(fā)現(xiàn)增加檢測(cè)血型抗原的數(shù)量，能夠有效減少異體輸血檢測(cè)假陰性發(fā)生的概率。意大利的Donati等人也有類似報(bào)道，他們發(fā)現(xiàn)，在8種基本血型抗原的基礎(chǔ)上增加另外5種（e，s，K，Lea，Leb）血型抗原后，能夠提高混合血樣的檢出率。然而，在實(shí)際興奮劑檢測(cè)工作中，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員無法得知所檢測(cè)樣品的運(yùn)動(dòng)員個(gè)人信息，這為根據(jù)不同種族運(yùn)動(dòng)員選擇不同血型抗原的個(gè)性化的檢測(cè)手段的實(shí)施帶來一定難度。因此，在近兩屆奧運(yùn)會(huì)異體血液回輸?shù)呐d奮劑檢測(cè)中，都只選擇了這8種基本血型抗原進(jìn)行檢測(cè)。
四、小結(jié)
最近新發(fā)現(xiàn)的肌腱源性干細(xì)胞（TDSC）因在肌腱組織中的修復(fù)潛能而逐漸獲得重視，但目前其對(duì)損傷肩袖腱－骨界面愈合作用機(jī)制研究鮮有報(bào)道。既往研究證實(shí)，TDSC具有向軟骨、骨分化的潛能，因此其在損傷肩袖腱－骨界面愈合過程中可能扮演著中介作用。Shen等提取兔肩袖組織TDSC并進(jìn)行培養(yǎng)，用于異體兔肩袖修復(fù)，結(jié)果顯示12周后實(shí)驗(yàn)組腱－骨界面結(jié)構(gòu)及生物力學(xué)指標(biāo)均優(yōu)于對(duì)照組，認(rèn)為異體TDSC可增加肩袖膠原沉積，且可分泌抗炎因子以避免免疫排斥反應(yīng)。Randelli等提取肩袖及肱二頭肌腱組織TDSC并進(jìn)行培養(yǎng)，比較TDSC與BMSC成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌骨骼細(xì)胞分化，結(jié)果顯示TDSC具備很好的分化潛能，且優(yōu)于BMSC。Tsai等的研究獲得了與此相同的結(jié)果，還發(fā)現(xiàn)肩袖來源干細(xì)胞可表達(dá)種系特異性基因如成骨誘導(dǎo)的Runx2及骨鈣蛋白、成脂分化的過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）－γ和脂蛋白脂肪酶（LPL），成軟骨分化的聚集蛋白聚糖及Ⅱ型膠原α1基因。Cheng等對(duì)腫瘤壞死因子－α刺激基因（TSG）－6在TDSC促進(jìn)肩袖腱－骨愈合過程中的作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果顯示TSG－6為保護(hù)性炎性反應(yīng)性基因，在多種炎癥性疾病或類似炎癥過程中呈高表達(dá)，參與細(xì)胞外基質(zhì)重塑，調(diào)節(jié)蛋白酶網(wǎng)絡(luò)，在多種關(guān)節(jié)炎中有限制炎癥、保護(hù)軟骨的作用；認(rèn)為TSG－6在TDSC促進(jìn)損傷肩袖腱－骨界面愈合過程中具有良好的調(diào)控作用。然而，目前仍存在TDSC含量較少、難以完全分離和純化、缺乏特異性表面標(biāo)志物等問題，且TDSC體外誘導(dǎo)分化定向誘導(dǎo)機(jī)制尚不清楚，因此還需進(jìn)一步研究。
2骨膜源性干細(xì)胞
骨膜可分為內(nèi)、外兩層，外層致密，有許多膠原纖維束穿入骨質(zhì)，使之固定于骨面；內(nèi)層疏松，可產(chǎn)生骨膜源性干細(xì)胞（PDSC）、成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞等。來自內(nèi)層的PDSC具有一定的分化潛能，因此被認(rèn)為可能在肩袖損傷愈合過程中具有一定的促進(jìn)作用。Chen等從大鼠脛骨骨膜組織中提取PDSC并進(jìn)行培養(yǎng)，將其與骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）－2制成凝膠混合物，采用該混合物對(duì)大鼠損傷肩袖進(jìn)行修復(fù)，術(shù)后4、8周進(jìn)行大鼠修復(fù)肩袖腱－骨界面組織學(xué)及生物力學(xué)分析，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組最大腱－骨界面實(shí)效負(fù)荷明顯高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，免疫組化顯示實(shí)驗(yàn)組修復(fù)界面存有聚集蛋白聚糖及Ⅱ型膠原蛋白，認(rèn)為PDSC與BMP－2的混合物可很好地促進(jìn)腱－骨界面纖維軟骨形成。目前大量實(shí)驗(yàn)將PDSC用于修復(fù)軟骨缺損、骨缺損及骨不愈合，但其用于損傷肩袖腱－骨界面的修復(fù)鮮有報(bào)道，因此PDSC如何在重建腱－骨界面結(jié)構(gòu)中發(fā)揮作用，仍需進(jìn)一步研究。
3脂肪源性干細(xì)胞文獻(xiàn)報(bào)道
脂肪源性干細(xì)胞（ADSC）與BMSC具有相似的分化潛能，其在合適的誘導(dǎo)劑作用下可分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞和神經(jīng)元樣細(xì)胞。此外，ADSC具有數(shù)量巨大、獲取方便、誘導(dǎo)安全、增殖迅速等特點(diǎn)，是一類有廣闊應(yīng)用前景的成體干細(xì)胞。Oh等采用ADSC修復(fù)兔慢性肩袖損傷模型，先切斷兔肩胛下肌腱，6周后形成慢性損傷，此時(shí)進(jìn)行肩袖修復(fù)，同時(shí)將ADSC注射入肩袖腱－骨區(qū)域及脂肪浸潤(rùn)的肩袖肌肉組織內(nèi)以對(duì)肩袖進(jìn)行加強(qiáng)修復(fù)，6周后從生物力學(xué)、肌電學(xué)、組織學(xué)方面對(duì)修復(fù)結(jié)果進(jìn)行分析，認(rèn)為ADSC可促進(jìn)損傷肩袖腱－骨愈合，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組肌肉組織脂肪浸潤(rùn)區(qū)域明顯較小。Kim等對(duì)兔亞急性肩袖損傷（切斷岡上肌3周）修復(fù)的同時(shí)，將ADSC注射入鄰近肌腹－肌腱移行部，術(shù)后3周觀察類胰島素樣生長(zhǎng)因子－Ⅰ受體（IGF－ⅠR）及肌球蛋白重鏈（MyHC）在注射部位的表達(dá)，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組IGF－ⅠR及MyHC表達(dá)明顯高于對(duì)照組（注射生理鹽水組），認(rèn)為ADSC促進(jìn)損傷肩袖修復(fù)有可能是通過IGF－Ⅰ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道完成的。雖然以上研究提示ADSC對(duì)退變性肩袖損傷具有促進(jìn)愈合作用，但已往大部分研究均認(rèn)為ADSC自我更新能力較差，不宜作為種子細(xì)胞。因•46•此，目前急需尋找更好的誘導(dǎo)劑，使其能更有效地分化成為目標(biāo)組織，從而更好地促進(jìn)損傷肩袖腱－骨界面愈合。
4肌源性干細(xì)胞體內(nèi)研究顯示
肌源性干細(xì)胞（MDSC）具有自我更新與多向分化潛能的特性，可再生為骨、軟骨、肌肉、血液、神經(jīng)及心臟組織。近期有研究報(bào)道MDSC同時(shí)具有肌腱組織的分化能力，但用于修復(fù)損傷肩袖研究鮮有報(bào)道。Pelinkovic等將MDSC用于修復(fù)裸鼠損傷岡上肌腱并進(jìn)行觀察，結(jié)果7d后細(xì)胞核呈紡錘形并集成肌腱膠原束，3周后檢測(cè)到β－半乳糖苷酶基因表達(dá)，表明MDSC分化成表達(dá)波形蛋白的成纖維細(xì)胞，提示肩袖肌腱基質(zhì)及原始細(xì)胞開始調(diào)控注射的MDSC向成纖維細(xì)胞分化；認(rèn)為MDSC因具有分化為成纖維細(xì)胞的能力而可用于肌腱愈合組織工程及肩袖損傷治療。
5滑囊源性干細(xì)胞滑囊源性
干細(xì)胞因肩峰下滑囊與肩袖緊鄰而被認(rèn)為有可能對(duì)肩袖修復(fù)產(chǎn)生一定的積極作用。Utsunomiya等將關(guān)節(jié)鏡下提取的人肩峰下滑囊組織進(jìn)行滑囊源性干細(xì)胞提取及培養(yǎng)，結(jié)果顯示肩峰下滑囊組織可作為生物修復(fù)肩袖損傷良好的干細(xì)胞來源；將其與肩袖殘端、滑膜組織中提取的干細(xì)胞進(jìn)行成骨化及擴(kuò)展性比較，結(jié)果顯示滑囊源性干細(xì)胞具有最佳的擴(kuò)展性及成骨性。Song等對(duì)在肩袖修補(bǔ)術(shù)中取出的部分肩峰下滑囊組織進(jìn)行滑囊源性干細(xì)胞提取及培養(yǎng)，并用流式細(xì)胞儀對(duì)其進(jìn)行分辨，排除造血干細(xì)胞及PDSC，再將此滑囊源性干細(xì)胞放于陶瓷支架中并將其植入裸鼠體內(nèi)，其中部分用BMP－12予以刺激分化，最終支架區(qū)域出現(xiàn)包含膠原蛋白的腱樣組織；因此認(rèn)為，作為新型來源的干細(xì)胞，滑囊源性干細(xì)胞具有腱性組織分化潛能，而BMP－12對(duì)該過程具有一定的促進(jìn)作用，滑囊源性干細(xì)胞有可能在肩袖損傷治療中產(chǎn)生積極作用。肩峰下滑囊組織經(jīng)肩關(guān)節(jié)鏡手術(shù)取材方便，對(duì)肩袖修復(fù)無影響，但目前滑囊源性干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究較少，仍處于起步階段，其促進(jìn)損傷肩袖愈合及進(jìn)行定向誘導(dǎo)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。
6結(jié)語
脫落細(xì)胞學(xué)檢查是臨床病理診斷的重要手段，一張高質(zhì)量的細(xì)胞涂片，能提高惡性病變檢出率。本院近年采用薄層液基細(xì)胞涂片技術(shù)（LPT），改進(jìn)細(xì)胞涂片方法，取得較好的效果。報(bào)道如下。
1材料與方法
1.1一般資料
隨機(jī)取本院2006年1月至2007年1月送檢標(biāo)本痰液、胸腹水、尿液及宮頸涂片計(jì)957例份，其中男523例，女434例。每例做常規(guī)涂片2張以作對(duì)照。
1.2離心機(jī)，振蕩器。
1.3液基細(xì)胞試劑
購(gòu)自利普公司，由2004年4月通過美國(guó)FDA認(rèn)證。
1.4常規(guī)細(xì)胞涂片
取宮頸刮片或痰液含血性或灰白粘稠區(qū)制成涂片2張；取胸腹水10ml，1000轉(zhuǎn)/min，離心10min，棄上清液，混勻沉淀物后涂片，干燥后95％酒精固定15min，HE染色后鏡檢。
1.5薄層液基細(xì)胞涂片
取宮頸刮出物或痰液含血性及灰白粘稠區(qū)入細(xì)胞基液，混勻靜置30min；取胸腹水、尿液等體液標(biāo)本50ml，2000轉(zhuǎn)/min，離心10min，棄上清液，混勻沉淀置入細(xì)胞基液30min，含血性物較多的可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。在備用試管內(nèi)倒入4ml清洗液，再加入含標(biāo)本（痰液、胸腹水、尿液等）的細(xì)胞基液，緩慢倒入，可見到分層現(xiàn)象。離心2000轉(zhuǎn)/min，10min，棄上清液，振蕩器混勻，加入等量的液基細(xì)胞涂片液，混勻涂片。干燥后95％酒精固定15min，HE染色后鏡檢。
2結(jié)果
957例液基細(xì)胞標(biāo)本共檢出惡性瘤細(xì)胞（含可疑）109例，宮頸18例為異常上皮細(xì)胞，本組就薄層液基細(xì)胞涂片與常規(guī)細(xì)胞涂片在靈敏度方面和鏡下特征進(jìn)行比較。
2.1胸腹水共檢407例，液基涂片檢出惡性瘤細(xì)胞（含可疑）73例，常規(guī)涂片64例，靈敏度提高12.3％；痰液共檢164例，液基涂片檢出陽性數(shù)8例，常規(guī)涂片6例，靈敏度提高25％；尿液共檢229例，液基涂片檢出陽性28例，常規(guī)涂片18例，靈敏度提高35.7％；宮頸涂片157例，液基涂片報(bào)告鱗狀上皮異常18例，常規(guī)涂片16例，靈敏度提高11.1％。見表1。表1兩種涂片方法對(duì)各種脫落細(xì)胞標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果比較（略）
2.2鏡下特征比較
(1)使用傳統(tǒng)方法制作的痰液涂片（宮頸涂片）較厚，粘液、雜質(zhì)及壞死物含量較多，細(xì)胞缺乏完整性，結(jié)構(gòu)模糊不清。漿膜腔積液涂片細(xì)胞堆積較厚，分布不均，含較多紅細(xì)胞，有紅染的背景（圖1）。(2)用薄層液基制作的涂片細(xì)胞面積縮小，涂片背景干凈；紅細(xì)胞大多消失，痰液和宮頸
涂片中粘液溶解；細(xì)胞層次分明，胞核胞質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰（圖2）。
3討論
脫落細(xì)胞學(xué)檢查是一項(xiàng)方便簡(jiǎn)單的檢查方法，它有利于癌癥篩查、早期發(fā)現(xiàn)癌癥、指導(dǎo)治療等。傳統(tǒng)的病理細(xì)胞學(xué)制片均采用直接涂片，推片或離心后涂片，制出的涂片細(xì)胞分布不均，重疊，背景含粘液、紅細(xì)胞、雜質(zhì)、壞死細(xì)胞等，影響鏡檢，陽性檢出率低。本組痰檢和尿液檢測(cè)靈敏度較低，主要是標(biāo)本取材不正確，痰液內(nèi)雜質(zhì)、粘液、炎性細(xì)胞過多，過厚而影響診斷；尿液中本身細(xì)胞含量較少，離心不徹底，涂片過稀導(dǎo)致細(xì)胞很少，缺乏有效的診斷細(xì)胞數(shù)。目前應(yīng)用的薄層液基細(xì)胞技術(shù)，挑取的細(xì)胞量較傳統(tǒng)細(xì)胞多，采取標(biāo)本后放入保存液中，及時(shí)軟化粘液和固定以保存細(xì)胞，加入清潔液通過分層離心技術(shù)去除標(biāo)本中的粘液、紅細(xì)胞及其他非細(xì)胞碎片，加入細(xì)胞后振蕩將細(xì)胞團(tuán)塊分散，形成單個(gè)細(xì)胞樣本，最后將細(xì)胞均勻地涂在載玻片上，進(jìn)行固定和染色。涂片時(shí)用細(xì)胞混懸液約30ul在玻片上涂成直徑1cm大小圓形分布區(qū)域，這樣使被檢細(xì)胞集中，數(shù)量多，易于閱片。LPT與常規(guī)制片方法比較，改善了樣本收集率，并使細(xì)胞均勻的分布在載玻片上，提高了檢出的陽性率。該技術(shù)不僅保存細(xì)胞的完整性，還保全了細(xì)胞抗原性，由于采集的細(xì)胞全部存放于細(xì)胞保存液內(nèi)而不被自溶及污染，可多量涂片進(jìn)行免疫組化染色及原位分子雜交［1］（圖3）。
薄層液基技術(shù)制片的優(yōu)良性，可明顯提高癌癥確診率，能為臨床提供可靠的診斷依據(jù)。在篩查宮頸癌方面，優(yōu)于傳統(tǒng)的巴氏涂片，采用TBS報(bào)告系統(tǒng)國(guó)際診斷標(biāo)準(zhǔn)，以得到了普遍認(rèn)可［2］。該技術(shù)用于痰液、尿液、漿膜腔積液也能提高惡性細(xì)胞檢出率,為臨床治療提供可靠的診斷依據(jù)。但LPT技術(shù)也有不足之處，成本較高，不能在基層醫(yī)院普及。在技術(shù)方面一些問題還有待改進(jìn)，如細(xì)胞固縮等。
【參考文獻(xiàn)】
經(jīng)典的iPSC技術(shù)路線主要包括以下步驟:①選擇宿主細(xì)胞;②選擇外源重組因子;③重組因子導(dǎo)入宿主細(xì)胞;④重編程產(chǎn)生iPSC;⑤iPSC的鑒定及分化。
1．1宿主細(xì)胞來源Yamanaka將小鼠體細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSC開啟了該技術(shù)的先河，之后人、大鼠、猴、豬、綿羊，甚至一些瀕危動(dòng)物的iPSC系紛紛建立。就人類而言，目前已從皮膚成纖維細(xì)胞、角質(zhì)成形細(xì)胞、羊水、神經(jīng)前體細(xì)胞、外周血細(xì)胞，甚至尿液中獲得iPSC。不同組織來源細(xì)胞重編程效率及所需因子不同。不僅iPSC分化能力因人而異，在表觀遺傳穩(wěn)定性和癌基因的表達(dá)方面也存在男女有別現(xiàn)象。使得iPSC技術(shù)應(yīng)用于臨床個(gè)體治療更具挑戰(zhàn)性。
1．2重組因子的選擇及導(dǎo)入方式經(jīng)典的Yamanaka因子在癌細(xì)胞中存在超表達(dá)、整合型載體可導(dǎo)致插入突變，且誘導(dǎo)效率非常低。因此，iPSC研究者一直致力于尋求更安全、簡(jiǎn)單、有效的誘導(dǎo)策略。Anokye-Danso等應(yīng)用微RNA調(diào)控技術(shù)，不使用轉(zhuǎn)錄因子高效誘導(dǎo)iPSC。Zhou等和Kim等分別利用Yamanaka四因子的融合蛋白和穿膜肽與轉(zhuǎn)錄因子蛋白的融合蛋白，直接誘導(dǎo)受體細(xì)胞為iPSC，但效率較低。一些學(xué)者利用腺病毒、質(zhì)粒載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，或利用Cre/LoxP系統(tǒng)、oriP/EBNAI系統(tǒng)及piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)將外源基因整合后再特異性切除，從而得到不含外源基因整合的iPSC，但是存在基因重排及效率低下現(xiàn)象。而一些小分子化合物(如丙戊酸、曲古抑菌素A、維生素C、篩選激酶抑制劑、BIX-01294、5-AZA、Wnt3a、Zscan4因子)的應(yīng)用可顯著提高iPSC的產(chǎn)生效率。
1．3iPSC的誘導(dǎo)分化Zhao等利用iPSC通過四倍體囊胚注射得到存活并具繁殖能力的小鼠，證明了iPSC的全能性。目前，人們已成功地將iPSC在體外定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞、造血細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、耳蝸毛細(xì)胞、色素細(xì)胞等類型細(xì)胞。
1．4iPSC機(jī)制相關(guān)研究突破研究人員長(zhǎng)期受困于體細(xì)胞重編程的具體機(jī)制。Polo等繪制出體細(xì)胞重編程為iPSC的分子線路圖，證實(shí)誘導(dǎo)過程引起了兩次轉(zhuǎn)錄波，分別是由c-myc/Klf4和Oct4/Sox2/Klf4驅(qū)動(dòng)，并確定了重編程過程中路障基因?；趇PSC技術(shù)已證明細(xì)胞的分化過程并非不可逆轉(zhuǎn)，研究人員利用細(xì)胞直接重編程技術(shù)將已分化細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化成特定譜系的細(xì)胞，利用間接譜系轉(zhuǎn)化技術(shù)部分去分化生成多潛能祖細(xì)胞，為干細(xì)胞研究開辟了新思路。
2臨床應(yīng)用前景
iPSC因其分化全能性、體外易擴(kuò)增、易于基因干擾或過表達(dá)等特性，在再生醫(yī)學(xué)、藥物研發(fā)評(píng)價(jià)、組織工程等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用前景。
2．1疾病特異iPSC動(dòng)物疾病模型由于種屬差異，不能真實(shí)反映人類疾病，利用疾病特異的iPSC系建立的iPSC疾病模型則可彌補(bǔ)這一缺陷，還可在免疫缺陷動(dòng)物體內(nèi)觀察疾病。當(dāng)前已建立包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病(帕金森病、亨廷頓病、肌萎縮側(cè)索硬化癥、脊髓性肌萎縮、唐氏綜合征、脆性X綜合征)，血液系統(tǒng)疾病(范科尼貧血、鐮刀細(xì)胞型貧血、β地中海貧血、原發(fā)性骨髓纖維化)，代謝系統(tǒng)疾病(1型糖尿病，Ⅲ型戈謝病，Shwachman-Bodian-Diamond綜合征、肌營(yíng)養(yǎng)不良、萊施-奈恩綜合征)及其他疾病(右心室心肌病)等特異的iPSC系。
2．2藥物研發(fā)及篩選大規(guī)模藥物篩選需要很多細(xì)胞，iPSC可以無限增殖，并且疾病特異iPSC本身就是篩選藥物的目標(biāo)。Takayama等導(dǎo)入Foxa2及肝細(xì)胞核因子1α到人類ESC/iPSC產(chǎn)生具有代謝功能的肝細(xì)胞樣細(xì)胞，對(duì)篩查藥物肝毒性具有重大意義。Lippmann等將iPSC轉(zhuǎn)化為血腦屏障的內(nèi)皮細(xì)胞，可用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物高通量篩選或藥物神經(jīng)毒性檢測(cè)。Egawa等利用肌萎縮側(cè)索硬化癥患者iPSC分化而來的神經(jīng)細(xì)胞來篩選并確認(rèn)藥物效果，發(fā)現(xiàn)漆樹酸具有改善神經(jīng)異常的作用。
2．3組織工程學(xué)應(yīng)用用干細(xì)胞培養(yǎng)的人體組織是理想的器官再造來源。英國(guó)已經(jīng)報(bào)道利用3D打印技術(shù)為癌癥患者重塑面部，F(xiàn)aulkner-Jones等將3D打印拓展到人ESC范圍，當(dāng)3D打印技術(shù)能夠兼容iPSC時(shí)，組織工程學(xué)將邁上一個(gè)新的臺(tái)階。
2．4臨床疾病治療
2．4．1神經(jīng)系統(tǒng)疾病帕金森病是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，目前治療手段只能改善癥狀。Kikuchi等利用iPSC分化出能產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)細(xì)胞，然后移植到帕金森病猴子腦部，這些細(xì)胞存活半年以上，并持續(xù)釋放多巴胺，很大程度上減輕了患病猴子的癥狀。Jiang等將帕金森病患者和健康志愿者皮膚細(xì)胞來源iPSC誘導(dǎo)為腦細(xì)胞并對(duì)比，觀察到parkin基因發(fā)生突變產(chǎn)生自由基破壞多巴胺神經(jīng)元是帕金森病發(fā)病機(jī)制之一。除帕金森病外，在阿爾茨海默病、脊髓側(cè)索硬化癥、脊髓肌肉萎縮癥及舞蹈癥等神經(jīng)退行性疾病研究中，iPSC也取得許多進(jìn)展。
2．4．2血液系統(tǒng)疾病Hanna等將人類鐮刀型貧血癥小鼠皮膚成纖維細(xì)胞建立的iPSC，通過同源重組技術(shù)獲得正?；蛐蚷PSC，誘導(dǎo)為造血干細(xì)胞并移植后可治療動(dòng)物模型的鐮狀細(xì)胞性貧血。Xu等用iPSC來源的內(nèi)皮前體細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞移植到血友病小鼠肝臟中，病鼠出血癥狀得到了改善。Raya等獲得了基因修飾后的貧血癥患者特異性iPSC，其能夠分化成表型正常的髓系和紅系造血祖細(xì)胞。最近，日本學(xué)者利用iPSC培養(yǎng)出一種能產(chǎn)生促紅細(xì)胞生成素的細(xì)胞，有望用于治療腎性貧血。
2．4．3心血管系統(tǒng)疾病2008年，Schenke-Layland等成功地將小鼠iPSC在體內(nèi)和體外分別誘導(dǎo)出了心肌細(xì)胞。之后，Nelson等將iPSC分化得到的心肌細(xì)胞移植入具有完整免疫系統(tǒng)的成年小鼠梗死心臟內(nèi)，能夠觀察到功能性的新生心肌。Tohyama等使用不含葡萄糖的低成本培養(yǎng)液獲得大量純度高達(dá)99%的心肌細(xì)胞，且?guī)缀醪淮嬖诎┗L(fēng)險(xiǎn)。而Zhang等證實(shí)iPSC具有分化為心房、心室和竇房結(jié)細(xì)胞等的潛能。
2．4．4感官疾病感音神經(jīng)性聾的主要原因是毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞退變和死亡，而其治愈需要相關(guān)結(jié)構(gòu)的修復(fù)或再生。Nishimura等將iPSC來源神經(jīng)祖細(xì)胞移植到小鼠耳內(nèi)，觀察到這些神經(jīng)細(xì)胞開始表達(dá)谷氨酸神經(jīng)元的標(biāo)志性因子，表明iPSC可用于螺旋神經(jīng)節(jié)損傷的再生修復(fù)。Oshima等使用小鼠ESC及iPSC成功分化出了功能性內(nèi)耳毛細(xì)胞。Mizutari等使用γ-分泌物抑制劑抑制Notch信號(hào)通路，刺激支持細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槊?xì)胞，首次證明成熟哺乳動(dòng)物的感音毛細(xì)胞也能再生。感音毛細(xì)胞的損傷導(dǎo)致聽力損失，感光細(xì)胞的損失則導(dǎo)致視力損失。Meyer等將iPSC分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，成功治愈1例回旋狀脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜萎縮癥患者。Singh等將發(fā)育中的感光細(xì)胞移植到盲鼠眼睛中，能夠再次形成視網(wǎng)膜的整個(gè)光敏感層，恢復(fù)視覺。
2．4．5內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病Tateishi等將正常人iPSC培養(yǎng)成胰島素分泌型的胰島細(xì)胞，其不僅能分泌C肽和胰高血糖素，而且能通過感受葡萄糖的刺激來調(diào)節(jié)C肽的分泌。Maehr等用1型糖尿病患者的成纖維細(xì)胞來源iPSC分化出了具有胰島素分泌功能的細(xì)胞。這些研究使糖尿病患者特異細(xì)胞治療成為可能。
2．4．6生殖系統(tǒng)疾病Park等將iPSC體外分化并分離得到原始生殖細(xì)胞，其與體內(nèi)分離的原始生殖細(xì)胞在基因表達(dá)上極相似。Hayashi等將小鼠ESC和iPSC在體外誘導(dǎo)成為原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞并分化為功能正常的和卵子。如果能進(jìn)一步將人原始生殖細(xì)胞體外分化為和卵子，就有望治療不孕不育癥。
2．4．7運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾病杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良是一種X染色體隱性遺傳病，患者早期即出現(xiàn)肌肉無力或萎縮，嚴(yán)重威脅生命安全。Filareto等將杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良小鼠皮膚細(xì)胞重編程為了iPSC，進(jìn)行遺傳修復(fù)，再分化成骨骼肌干細(xì)胞進(jìn)行移植治療，能產(chǎn)生功能性肌肉，并檢查到新形成的肌纖維表達(dá)修復(fù)后的標(biāo)記，證明了iPSC技術(shù)結(jié)合遺傳修復(fù)技術(shù)治療杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良的可行性。Diekman等利用iPSC在小鼠實(shí)驗(yàn)中培育出無再生能力的軟骨，有望成為人造軟骨組織的來源。
2．4．8腫瘤Chen等用小鼠iPSC培育出了癌癥干細(xì)胞，并確認(rèn)其發(fā)展成癌細(xì)胞的過程。Yang等發(fā)現(xiàn)人類iPSC來源的神經(jīng)干細(xì)胞可以靶向腫瘤，或可用于聯(lián)合基因治療，抑制腫瘤生長(zhǎng)。Vizcardo等從惡性黑色素瘤患者體內(nèi)提取出T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)出iPSC再分化成為T淋巴細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)這些T細(xì)胞能夠識(shí)別黑色素瘤特異性蛋白黑色素瘤抗原1，繼續(xù)攻擊癌細(xì)胞。此方法能夠大量培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞，有望在此基礎(chǔ)上開發(fā)出治療癌癥的新型免疫療法。
2．4．9其他人類疾病CCR5(C-Cchemokinereceptortype5)是人類免疫缺陷病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的重要輔助受體，缺乏CCR5使人類免疫缺陷病毒不能感染人體。Yao等用鋅指核酸酶技術(shù)剔除患者iPSC的CCR5基因，并誘導(dǎo)成造血干細(xì)胞，為艾滋病的治療提供一條新的可能途徑。Arakaki等將小鼠iPSC與小鼠齒源性上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化為成釉細(xì)胞，且含有作為牙釉質(zhì)成分的成釉蛋白，這對(duì)牙齒再生和修復(fù)研究至關(guān)重要。
3展望
