時間：2023-03-22 17:42:10
序論：在您撰寫細胞生物學論文時，參考他人的優(yōu)秀作品可以開闊視野，小編為您整理的7篇范文，希望這些建議能夠激發(fā)您的創(chuàng)作熱情，引導您走向新的創(chuàng)作高度。
關鍵詞:醫(yī)學細胞生物學;教學模式;教學改革
醫(yī)學細胞生物學是一門以細胞生物學和分子生物學為基礎，探索研究人體細胞發(fā)生、發(fā)育、增殖、衰老、死亡以及細胞結構與功能的異常與人類疾病關系的學科［1］。醫(yī)學細胞生物學是臨床醫(yī)學、檢驗醫(yī)學、口腔醫(yī)學、預防醫(yī)學等醫(yī)學專業(yè)的一重要基礎課，同時也是生理學、病理學、免疫學、組織胚胎學、藥理學等醫(yī)學基礎課程以及后續(xù)臨床課程的基礎［2］。學習醫(yī)學細胞生物學的基本理論知識有助于醫(yī)學專業(yè)學生從分子細胞層面理解人體生命活動規(guī)律和疾病發(fā)生發(fā)展進程，為專業(yè)課學習和后續(xù)的科研工作奠定堅實的理論基礎［3］。醫(yī)學細胞生物學是一門實驗操作性極強的學科，實驗教學是這門課程教學工作中的重要實踐環(huán)節(jié)，在培養(yǎng)學生動手能力、實踐探索能力和科學創(chuàng)新能力等方面具有重要作用［4-6］。傳統(tǒng)的教學理念和教學方法已經(jīng)不能滿足新時代的需要，如何能在有限的時間內，讓學生系統(tǒng)掌握醫(yī)學細胞生物學的基礎理論知識，并熟練掌握基本實驗操作技術，是新形勢下醫(yī)學細胞生物學教學改革的一項重要內容［7-8］。本文結合鄭州大學基礎醫(yī)學院的實際情況，對醫(yī)學細胞生物學理論課及實驗課教學中存在的問題及改革策略進行探討并提出建議，以提高醫(yī)學細胞生物學教學質量。
1提高醫(yī)學細胞生物學理論課教學質量的建議
1．1理論課教學內容的改革
首先，針對不同專業(yè)，因材施教。臨床醫(yī)學、檢驗醫(yī)學、法醫(yī)學、臨床藥學、預防醫(yī)學等專業(yè)均需要開設醫(yī)學細胞生物學。任課教師應該結合教學大綱并根據(jù)教材內容，為不同專業(yè)的學生制定相應的教學計劃和授課內容，按照學校的課程設置，多方面、多角度、多層次因材施教，提高醫(yī)學細胞生物學的課堂教學效果。其次，注重基礎理論，由淺入深。注重教學內容的基礎性，構建并完善由細胞基本結構及其功能、細胞重大生命活動現(xiàn)象及本質等所組成的理論教學體系，加強學生對基本理論知識及基礎實驗技術的理解。授課教師應該以真核細胞的結構與功能為教學重點，使學生對細胞的主要結構及其功能等有系統(tǒng)、全面的了解和認識。然后，精煉教材內容，突出重點。醫(yī)學細胞生物學課程的內容較多，但課時有限，所以，任課教師應精煉教材內容，有的放矢授課。該門課程的必修內容是認識人類自身生命活動的基礎，也是認識疾病發(fā)生、發(fā)展的理論基礎。授課教師在授課過程中要注意精練授課內容，突出重點章節(jié)，同時，課后需要對本節(jié)課的內容進行歸納總結。
1．2理論課教學方法的改革
首先，使用啟發(fā)式教學。授課教師應該在課堂上開展啟發(fā)式教學，實現(xiàn)教師與學生的課堂互動。啟發(fā)式教學相比傳統(tǒng)單純由教師講課的教學方式更具有優(yōu)勢，可以更加有效地激發(fā)學生的學習興趣。啟發(fā)式教學不但注重知識的傳授，更注重能力培養(yǎng)，因此，啟發(fā)式教學可提高學生的思維能力和創(chuàng)新能力。其次，使用多媒體教學。醫(yī)學細胞生物學課程中有很多細胞結構圖和分子機制圖需要制作成動畫，以使復雜抽象的內容變得直觀有趣，調動學生的學習主動性，增強學生的學習興趣。同時，任課教師可以充分利用網(wǎng)絡資源，搜集醫(yī)學細胞生物學的視頻課件資料并運用到課堂教學中。這樣既可以拓展學生的學術視野，又可以提高學生的綜合素質。然后，使用案例式教學。案例教學是在事實案例基礎上的一種開放式、互動式的新型教學方式。醫(yī)學專業(yè)學生不僅要掌握細胞的結構、功能，還應該熟悉細胞的病理改變與疾病發(fā)生發(fā)展的關系。但是由于醫(yī)學細胞生物學課程的理論性強、內容抽象，所以任課教師應該積極探索案例式教學，以激發(fā)學生的學習興趣，提高醫(yī)學細胞生物學的教學質量。
1．3理論課考試方式的改革建議
首先，優(yōu)化考試內容。任課教師可以通過以下幾點優(yōu)化理論課程的考試內容:(1)建立和完善理論課程的考試題庫，保證理論課程考試的有效性;(2)根據(jù)本院開設的臨床醫(yī)學、檢驗醫(yī)學、預防醫(yī)學等專業(yè)設置相對應的考試題目;(3)指導學生撰寫綜述性論文或科研標書，以培養(yǎng)醫(yī)學專業(yè)學生良好的思維能力和創(chuàng)新意識。其次，優(yōu)化考試形式。任課教師可以通過以下方法優(yōu)化理論課程的考試方式:(1)構建綜合豐富的考試方式。建立平時成績和期末考試成績相結合的考試體系;(2)增加創(chuàng)新能力考試的比重。任課教師讓學生按照要求寫出科研標書并進行打分;(3)增加平時表現(xiàn)考試的比重。平時表現(xiàn)考試主要是在課堂上對學生回答問題的情況予以評分并記錄。然后，優(yōu)化評價方案。任課教師可以通過調整期末閉卷考試及平時表現(xiàn)考試優(yōu)化評價方案。理論課考試中的期末閉卷考試成績占理論課總成績的70%，試題從考試題庫中隨機抽取。同時理論課考試中也包含學生的平時成績，這一部分占總成績的30%，包括學生的出勤情況、課堂上回答問題的情況以及學生完成綜述性論文的情況。
2提高醫(yī)學細胞生物學實驗課教學質量的建議
2．1實驗課教學內容的改革建議
首先，優(yōu)化實驗教學大綱。由于受到課堂學時及硬件條件等方面的制約，很多院校的醫(yī)學細胞生物學課程的實驗課內容僅僅局限在一些驗證性和基礎性的實驗。任課教師需要調整教學內容，增開一些與理論課程密切相關并且與學科前沿緊密聯(lián)系的綜合設計實驗。這樣可以激發(fā)學生的學習興趣，更好地發(fā)揮學生的積極性和主觀能動性。其次，培養(yǎng)學生創(chuàng)新能力。任課教師可以在基礎性實驗之外開設一些探索性及創(chuàng)新性較強的綜合實驗，例如細胞融合實驗、細胞凋亡實驗、細胞免疫組織化學實驗和免疫熒光實驗等。培養(yǎng)并提高學生的實際操作能力以及分析問題和解決問題的能力，使學生初步具備進行設計性實驗的能力，提高學生的科研素質和創(chuàng)新能力。然后，設置開創(chuàng)綜合實驗。任課教師應當結合理論課內容及相關臨床應用，修改完善實驗課教學大綱，科學設置實驗內容，培養(yǎng)學生的實驗操作能力，以增強學生的科研興趣為重點，在實驗課教學中適當增加一些開放性強且創(chuàng)新性強的綜合實驗，讓學生運用已掌握的知識與技術進行更深入的研究設想，培養(yǎng)獨立科研工作的能力。
2．2實驗課教學方法的改革建議
首先，應用啟發(fā)式教學。與傳統(tǒng)的實驗課教學相比，在啟發(fā)式的實驗課教學中，任課教師應該在講解實驗目的和原理后，鼓勵學生根據(jù)所學的知識設計實驗過程，然后分析研究最后得到的實驗結果以探索實驗原理。采用啟發(fā)式教學可以培養(yǎng)學生的思維能力，引導學生積極思考，啟發(fā)學生從不同的角度考慮問題，期提高學生的綜合科研素質。其次，使用多媒體教學。在醫(yī)學細胞生物學的實驗課教學中，多媒體技術的應用能夠極大地方便課堂教學工作。多媒體教學形象生動、易于理解，可以方便地解決一些不容易講解或者難以開展的實驗。另外對于某些受條件所限而不便親自操作的實驗，學生可以觀看教學演示片，全面了解這些前沿實驗儀器的結構、性能和用途。然后，開展研究型教學。醫(yī)學細胞生物學的實驗課程與科研工作相結合可以提高學生的學習興趣和科研熱情。任課教師在實驗課堂上采用開放式的研究型教學可以激發(fā)學生的求知欲，讓學生學會分析問題和解決問題。開放式研究型的實驗課教學，讓學生經(jīng)歷嚴格的科研訓練，為以后申報、參與以及實施各種創(chuàng)新性科研項目奠定基礎。
2．3實驗課考試方式的改革建議
首先，優(yōu)化考試內容。為全面、科學地考察學生的實際動手能力以及科研創(chuàng)新能力，改革后的醫(yī)學細胞生物學實驗課的考試內容應該以核學生的實驗操作水平為主，以考試學生的理論知識水平為輔。這種改革模式，可以培養(yǎng)學生在實驗操作過程中分析問題、解決問題的能力，并拓寬學生對實驗操作技術在臨床應用中的思考。其次，優(yōu)化考試形式。建立完善的成績評定體系是保證實驗教學質量的關鍵。實驗課程的考試應是一個全方位、多角度、全時段的綜合評測，包括平時課堂考試及綜合實驗考試，平時課堂考試包括出勤情況、課堂回答問題情況和實驗操作情況、實驗報告完成情況，綜合實驗考試包括實驗理論考試、實驗操作考試、開放性及探索性實驗考試等。然后，優(yōu)化評價方案。實驗課的考察應該以考察學生運用實驗技術的能力為主，包括以下幾點:(1)考察學生的平時成績，包括出勤情況、實驗報告完成情況等，占實驗課總成績的20%;(2)考查學生的理論水平，包括實驗基本原理、實驗技術手段、實驗操作方法等，占實驗課總成績的20%;(3)考察學生的實驗操作，占實驗課總成績的60%。綜上所述，醫(yī)學細胞生物學的教學是教師與學生共同學習、教學相長的過程。在這個過程中，首先任課教師需要不斷提高自身素質，認真做好科研工作并積極學習本課程最先進的理論知識與最前沿的實驗技術。其次，任課教師也需要精心把握課程內容，不斷總結教學經(jīng)驗，比較各種教學方法的優(yōu)劣，并將各種教學方法有機結合、交叉運用。同時，任課教師可以根據(jù)學生的不同專業(yè)方向，改進傳統(tǒng)教學模式中教案和課件的內容，在上課時適量引入案例教學，從而調動學生的學習興趣，提高學生的綜合素質。另外，任課教師也需要加強實驗課教學的比重，改革實驗教學內容，完善實驗教學條件，采用多種教學手段，建立完善評價體系，并不斷探索研究新實驗，使實驗課堂更富有學術氣氛。以上這些舉措是提高醫(yī)學細胞生物學的教學質量，培養(yǎng)適應現(xiàn)代社會發(fā)展的具有較強的綜合能力和科研素質，具有獨立發(fā)現(xiàn)問題、思考問題、分析問題及解決問題能力的創(chuàng)新型醫(yī)學專業(yè)人才。
作者:鄭皓 單位:鄭州大學基礎醫(yī)學院醫(yī)學遺傳與細胞生物學系
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RT-PCR檢測耐藥相關基因MDR1、BCL2L1、LRP、PRKCA的表達取對數(shù)生長期細胞，TRIzol試劑提取細胞總RNA，反轉錄試劑盒合成cDNA，SYBYGreen方法進行實時熒光定量PCR實驗。引物設計由Invitrogen公司合成，見表1。PCR反應體系：cDNA1μl，2×SYBRGreenPCRMastermix12μl，引物F/R（上下游引物的終濃度各為15pmol/μl）各0.3μl，DEPC水11.4μl，共25μl。PCR循環(huán)設置：50℃2min95℃10min（95℃15s60℃1min）×40個循環(huán)（生成擴增曲線）95℃15s60℃15s95℃15s（生成溶解曲線）。SDS2.2軟件分析處理數(shù)據(jù)，管家基因校正目的基因的表達，得到相對定量結果。1.6耐藥細胞的保存耐藥細胞SKOV3/TAX30分別凍存于含0、10、30nmol/L紫杉醇藥物的凍存液里。于凍存后1、3、6月分別復蘇細胞，觀察復蘇情況，MTT法檢測IC50。1.7統(tǒng)計學方法對有關數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進行獨立樣本t檢驗（independentsamplet-test）、單因素方差分析（OnewayANOVA），P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2、結果
2.1耐藥細胞的建立
SKOV3經(jīng)300μg/ml大劑量的紫杉醇作用2h后,大部分細胞死亡漂浮，剩余細胞腫脹，伸出樹枝狀突起呈蜘蛛狀，胞質見空泡形成、顆粒增多。少量存活的細胞克隆生長，恢復生長至對數(shù)期消化傳代，再進行下一次沖擊；SKOV3經(jīng)10~30nmol/L小劑量的紫杉醇作用24h，約50%的細胞死亡，細胞體積增大，形態(tài)不規(guī)則，胞質內顆粒增多，貼壁性變弱，給藥24~72h內最明顯，96~120h后逐漸恢復原狀。經(jīng)兩種誘導方法獲得的耐藥細胞系，分別命名為SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30。
2.2耐藥細胞的生物特性
2.2.1耐藥指數(shù)MTT實驗結果顯示，耐藥細胞及其敏感細胞的IC50值及耐藥指數(shù)，可見小劑量濃度遞增誘導的耐藥細胞SKOV3/TAX30耐藥性較強，見表2。2.2.2平板克隆形成實驗在無藥物作用時，SKOV3敏感細胞較兩種耐藥細胞系的克隆形成能力強，見圖1A的d組，SKOV3敏感細胞的克隆形成數(shù)為（934±16.37），SKOV3/TAX300的克隆形成數(shù)為（440±13.75）,SKOV3/TAX30的克隆形成數(shù)為（579±9.50）。與敏感細胞SKOV3相比，兩種耐藥細胞克隆形成數(shù)少，差異有統(tǒng)計學意義（P均=0.000），見圖1B。而在相同濃度紫杉醇作用下，耐藥細胞形成的克隆明顯多于敏感細胞。在紫杉醇濃度為5nM時，SKOV3/TAX30可形成（1206±9.50）個克隆，SKOV3/TAX300可形成（870±32.30）個克隆，而SKOV3形成的克隆數(shù)僅（202±6.08），差異有統(tǒng)計學意義（P均=0.000）；當紫杉醇濃度進一步升高為50nM和500nM時，SKOV3/TAX30和SKOV3/TAX300形成的克隆數(shù)仍明顯高于敏感細胞SKOV3。紫杉醇濃度為50nM時，SKOV3細胞與SKOV3/TAX300細胞形成的克隆數(shù)相比，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.013）,SKOV3細胞與SKOV3/TAX30細胞形成的克隆數(shù)相比，差異也有統(tǒng)計學意義（P=0.000）；紫杉醇濃度為500nmol/L時，SKOV3細胞與SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30細胞形成的克隆數(shù)相比，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.009、0.0001），見圖1B。2.2.3生長曲線倍增時間的差異SKOV3敏感細胞和兩種耐藥細胞系在相同條件下培養(yǎng)7天，細胞增殖產(chǎn)生一定的差異。耐藥細胞的生長較敏感細胞減慢，生長曲線的斜率減小，見圖2。同時，根據(jù)生長曲線計算出SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30細胞的倍增時間分別為28.90h、24.0h，與敏感細胞的倍增時間20.84h相比也有所延長。
2.3耐藥相關基因
MDR1、BCL2L1、LRP、PRKCA在各細胞中的表達MDR1、BCL2L1、LRP、PRKCAmRNA在SKOV3、SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30細胞中的相對表達豐度見圖3A、3B。兩種耐藥細胞中，MDR1的表達明顯增高，提示SKOV3/TAX300、SKOV3/TAX30對紫杉醇的耐藥與MDR1高表達有關。SKOV3/TAX300細胞中PRKCA、LRP的表達均高于SKOV3細胞，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.016，P=0.005），BCL2L1的表達與敏感細胞比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.815）。而SKOV3/TAX30細胞的PRKCA、LRP的表達與敏感細胞比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.154，P=0.206）。BCL2L1的表達低于敏感細胞（P=0.001），見圖3B。以上數(shù)據(jù)表明不同誘導方式導致耐藥細胞發(fā)生不同生物學變化，可能存在不同的耐藥機制。
2.4耐藥細胞的保存
耐藥細胞SKOV3/TAX30分別凍存在含有0、10、30nM紫杉醇的凍存液中，于凍存后1、3、6月復蘇，檢測IC50，見表3。1、3月后檢測結果提示，在3種藥物濃度條件下的細胞IC50沒有明顯區(qū)別，但凍存6月后，無藥凍存組的耐藥細胞與兩種加藥凍存組的細胞比較，其IC50明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。同一個藥物濃度條件下，無藥凍存組的耐藥細胞在凍存6月時，出現(xiàn)耐藥性下降，而兩種加藥凍存組細胞在6月的凍存過程中，細胞IC50雖然出現(xiàn)輕度下降，但差異無統(tǒng)計學意義。
3、討論
3.1耐藥細胞的建立
本實驗結果提示：增加給藥劑量、適當延長無藥間歇期，可能延緩細胞的耐藥性。由于大劑量沖擊誘導與臨床治療模式相似，臨床上體內耐藥指數(shù)≥2倍即足以導致化療失敗[5]，因此大劑量沖擊誘導產(chǎn)生的耐藥細胞雖然耐藥指數(shù)較低，也是模擬臨床耐藥的良好模型。
3.2耐藥細胞的特性
本研究的結果表明：在無藥物作用時，SKOV3細胞的集落形成能力強于兩種耐藥細胞SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30，但在不同濃度紫杉醇藥物條件下，耐藥性最強的SKOV3/TAX30集落形成能力也最強，而敏感細胞SKOV3的集落形成能力最弱，此結果與MTT法檢測的耐藥性一致。紫杉醇的作用機制是促進微管蛋白二聚體裝配成微管，抑制紡錘體形成，將細胞阻斷于G2/M期，細胞的有絲分裂異常或停止，使多核細胞的形成增多[6]。誘導的過程中耐藥細胞膨脹、形態(tài)不規(guī)則、細胞體積的增大可能與細胞群體中多核細胞的增多有關。本研究的生長曲線實驗中，SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30的倍增時間分別為28.9、24.0h，與敏感細胞SKOV3的倍增時間20.84h相比有明顯延長，顯示耐紫杉醇的卵巢癌細胞生長速度減慢。細胞周期的阻滯，除導致一些細胞周期特異性藥物失效外，腫瘤細胞處于相對靜止狀態(tài)，易對化療藥物產(chǎn)生耐受。
3.3耐藥相關基因的檢測
卵巢癌紫杉醇耐藥機制的研究中，多藥耐藥（multidrugresistance，MDR）一直是熱點。多藥耐藥是指對一種藥物具有耐藥性的同時，也對其他結構和作用機制完全不同的化療藥物產(chǎn)生交叉耐受的一種現(xiàn)象。多藥耐藥的產(chǎn)生是一個多因素的過程，主要包括：（1）細胞內有效藥物濃度的降低；（2）細胞內藥物活性的改變；（3）凋亡的抑制；（4）腫瘤細胞微環(huán)境改變化療敏感度。P-gp是多藥耐藥基因MDR1編碼的相對分子質量為17kD的一種跨膜糖蛋白，其功能是使細胞內藥物濃度降低，藥物的作用減弱或喪失，細胞由此獲得耐藥性。與大多數(shù)其他化療藥物的多藥耐藥機制相似，紫杉醇作為P-gp的作用底物之一，其耐藥機制與MDR1基因擴增導致的P-gP高表達密切相關[7-8]。肺耐藥相關蛋白LRP是在多藥耐藥的肺癌細胞株中發(fā)現(xiàn)的與MDR相關的非糖蛋白，相對分子質量為110kD，能阻止藥物通過核孔進入細胞核，避免其作用于核內靶點，藥物運送到胞質的囊泡中，再通過胞吐作用將藥物排出體外，從而發(fā)生紫杉類藥物耐藥[9-10]。凋亡抑制基因也參于紫杉醇耐藥。BCL2L1基因，全稱為BCL-2樣1基因（BCL-2-like1）,編碼蛋白屬于BCL-2蛋白家族，BCL-2蛋白家族通過抑制腫瘤細胞凋亡，導致耐藥性[11-12]。PRKCA基因為蛋白激酶Cα（proteinkinaseCalpha），也被稱為PKCA、PRKACA、KPCA、AAG6。細胞過度增殖和抗細胞凋亡機制障礙都可導致腫瘤進展和耐藥現(xiàn)象發(fā)生[13]。另外PKC的作用是使底物蛋白磷酸化而活化，p-gp是PKC的作用底物，當其表達增加或活性增強時，可使大量的P-gp磷酸化而活化，從而產(chǎn)生耐藥性。本研究結果提示。SKOV3/TAX300細胞PRKCA、LRP的表達均略高于敏感細胞。但SKOV3/TAX30細胞的PRKCA、LRP的表達與敏感細胞比較差異無統(tǒng)計學意義。BCL2L1在SKOV3/TAX30細胞的表達低于敏感細胞，但SKOV3/TAX300細胞中BCL2L1的表達略高于敏感細胞，結果提示不同方式誘導的耐藥細胞，可能存在不同的耐藥機制。
3.4耐藥細胞的保存
1．1組織塊貼壁法分離培養(yǎng)hUC-MSCs臍帶取自正常分娩的新生兒(征得其父母同意)。首先用含雙抗的磷酸鹽緩沖液(PBS)浸洗臍帶3次，去除雜物;用無菌的手術剪刀將臍帶剪成3～4cm的節(jié)段，再沿長度方向剪開，以暴露臍帶膠質部分，去除血管;置于含雙抗的PBS中清洗3次，去除血污，再剪成約0．5cm3的組織塊，以膠質部分貼于基底平鋪于24孔板中，每孔2～3塊，置于37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱孵育1～2h;待組織塊自然粘附于皿底部后加入含雙抗、FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，每3d更換一次培養(yǎng)基，待觀察到有小三角形或梭形細胞從組織中鋪展出時，取出組織塊。整個分離過程注意無菌操作。待細胞生長至70%～80%匯合時，即可傳代。利用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)。取第5代細胞，采用細胞免疫熒光技術鑒定hUC-MSCs的表面標記物CD44。
1．2肝細胞標志基因的檢測按照總RNA提取試劑盒的操作說明分別提取hUC-MSCs和人肝癌細胞HepG2的總RNA，用RNase-FreeDNaseⅠ去除基因組，最后檢測RNA的濃度和純度，立即進行反轉錄合成cDNA或保存于－80℃?zhèn)溆?。采用Prime-ScriptTMⅡHighFidelityRT-PCR試劑盒反轉錄2μgRNA得cDNA，取2μL用于PCR。根據(jù)GenBank提供的人肝細胞標志基因序列，使用PrimerPremier5．0軟件設計引物，引物序列和產(chǎn)物大小見表1。GAPDH為內參對照。PCR反應條件:94℃預變性5min;94℃變性30s，56℃退火45s，72℃延伸30s，30個循環(huán);最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物用20g/L的瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠分析系統(tǒng)下拍照。
1．3PAS糖原染色按照PAS染色試劑盒的說明書操作，對第5代hUC-MSCs和HepG2進行糖原染色，在倒置相差顯微鏡下觀察并照相。
2結果
2．1hUC-MSCs的分離、培養(yǎng)、傳代及鑒定組織塊貼壁培養(yǎng)3～4d時，可觀察到組織塊間隙鋪展出小三角形或長梭形的細胞，繼續(xù)培養(yǎng)至7d左右，可觀察到局部細胞呈集落生長，此時，在無菌條件下取出組織塊，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1周左右，細胞可達80%～90%匯合，即可傳代。用胰酶/EDTA消化后細胞呈亮而圓的單個分散狀，以1∶3的比例進行傳代，約4h貼壁，2d后迅速生長。倒置相差顯微鏡下可觀察到細胞較大，輪廓清楚，內部有清晰的應力纖維，多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結構，細胞核呈規(guī)則的卵圓形，核仁大而明顯，呈典型的成纖維細胞樣形態(tài)(圖1A);持續(xù)培養(yǎng)大約2周時，細胞基本達到完全匯合，形態(tài)發(fā)生一定的變化，胞質變得狹窄，內部的應力纖維也不明顯，呈平行排列或漩渦生長(圖1B)。連續(xù)多次傳代，細胞保持穩(wěn)定的、相對均一的成纖維細胞樣形態(tài)以及較強的增殖能力。經(jīng)鑒定分離培養(yǎng)的細胞CD44呈陽性表達，且具有良好的均質性。
2．2肝細胞標志基因的表達以HepG2作為陽性對照，用RT-PCR檢測hUC-MSCs的肝細胞標志基因的表達情況，結果見圖2，hUC-MSCs表達ALB、CK18、G6P、GLUL和MET，不表達TAT。
2．3PAS糖原染色結果對hUC-MSCs和HepG2進行PAS糖原染色，染色結果顯示兩種細胞的細胞質中均有紫色顆粒物形成，即均呈糖原陽性反應(圖3)。
3討論
MSCs能分泌多種細胞因子和生長因子，具有直接或間接的抗炎及抗纖維化作用，可抑制肝細胞的死亡和纖維化;還可通過其分泌物抑制肝細胞的凋亡、刺激肝細胞再生、為受損肝細胞提供營養(yǎng)支持等。MSCs還具有低免疫原性及免疫抑制力，適用于進行同種異體移植，在移植后可遷移、歸巢至受損的組織，發(fā)揮治療作用。因此，MSCs在肝臟疾病的細胞移植治療中具有廣闊的應用前景。研究發(fā)現(xiàn)，相較不同來源的MSCs，臍帶來源的MSCs不僅具有干細胞的特性，而且來源豐富、取材方便、增殖能力較強、無倫理法律限制，還具有較低的免疫原性和分化程度，從而成為一個非常有吸引力的移植治療肝病的細胞來源。
作者采用組織塊貼壁培養(yǎng)法從臍帶基質中分離獲得hUC-MSCs，與酶消化法和流式細胞儀或免疫磁珠分選法相比，該分離方法操作簡單，消耗低，易于控制。分離培養(yǎng)的hUC-MSCs呈典型的成纖維細胞樣形態(tài)，具有MSCs的表型特征，均質性良好，且在體外長期培養(yǎng)中能保持穩(wěn)定狀態(tài)。進一步的RT-PCR結果顯示，培養(yǎng)的hUC-MSCs同時表達成熟肝細胞的標志基因ALB、CK18、G6P、GLUL和MET，而不表達TAT，與Campard等的研究結果一致，提示hUC-MSCs可能具有肝細胞的一些相關功能，如合成白蛋白、合成糖原及解毒功能等;PAS糖原染色結果則證明hUC-MSCs具有糖原合成和儲存能力。
經(jīng)濟的迅猛發(fā)展帶動科技的日新月異，網(wǎng)絡技術與通信技術發(fā)展迅速，微信、微博等交流媒介成為大眾知識共享的傳播平臺，而微課作為教學中的創(chuàng)新也備受關注，作為對傳統(tǒng)教學模式的顛覆，其更注重教學效率的提升與教學質量的理想化。伴隨移動學習時代的到來，微課使得當前學校教育及社會教育都發(fā)生了顯著的變化。但是我們應該看到，時代催生的網(wǎng)絡視頻也帶有某種弊端性，難以真實有效地滿足各個層面的學習需求[1]。焦建利教授提出：傳統(tǒng)的課堂實錄視頻資源已經(jīng)難以實現(xiàn)互聯(lián)網(wǎng)時代人們注意力模式的匹配，因此傳統(tǒng)的教學方式也很難滿足師生教與學的需求。
加上網(wǎng)速及寬帶的硬性限制，教學資源周轉率低，優(yōu)秀教育教學資源被無形浪費?；谶@樣的背景，微課誕生，吸取了傳統(tǒng)教學視頻的弊端教訓，更注重主題的突出明確，更具有針對性與服務性，在內容設置上也趨于短小精悍，實現(xiàn)了自由補充與延伸[2]。對于生物細胞學科教學來說，實驗是教學的關鍵，在教學中發(fā)揮著重要的作用。不可否認的是生物學作為生命科學的前沿學科之一，無論是實驗技術方法還是理論知識闡述都實現(xiàn)了深度的提升與廣度的延伸，逐漸實現(xiàn)與遺傳學、分子生物學及發(fā)育生物學的學科融合，逐漸在生命科學研究領域占據(jù)主導[3]。因此，實現(xiàn)微課與細胞生物學實驗教學的結合，對學生創(chuàng)新能力與獨立思考能力的培養(yǎng)逐漸成為生物實驗教學關注的焦點，成為細胞生物學實驗教學改革的要務。
一、微課簡述
1.微課的起源。微課最早由美國愛荷華大學LeRoy A. McGrew教授提出，初衷是針對化學課程總結的60秒概述，設置了三大主體部分，分別為總體介紹、解釋說明及舉例分析。后來英國學者T.P.Kee在此基礎上提出了一分鐘演講，所謂的一分鐘演講就是突出演講的精練傳神，要求具有縝密的邏輯結構及真實生動的案例闡述。在經(jīng)過上述兩個階段的發(fā)展后，微課由美國新墨西哥州圣湖安學院大衛(wèi).m.彭羅斯提出并創(chuàng)建實施。其包括15到30秒的介紹及結論，服務與上文的關鍵概念導引。然后錄制上述內容并限制時間為3分鐘內，在微課程指引下提出書面作業(yè)要求，學會借助課外閱讀或者實踐活動完成關鍵知識的學習。目前最具代表性的當屬Educause的微課理念，不是指微觀學習中的微內容，而是以建構主義學習理論為支撐的在線教學或格式化教學中的教學實際。
2.我國微課發(fā)展現(xiàn)狀。我國微課依然是新興事物，起步晚，發(fā)展相對緩慢，目前涉及領域也有部分處于空白?；谖⒄n的發(fā)展現(xiàn)狀，當前學術界也未就微課理念達成共識。學者焦建利[4]認為，微課是對某一知識點的集中闡釋，主要特點就是短小精悍，在線教學視頻是其主要表現(xiàn)形式。學者祝智庭[5]則認為微課應該就某個教學主題展開延伸，組織精細化的課堂教學設計，時間限度最好控制在10分鐘以內。而學者胡鐵生[6]則認為微課程注重的是視頻的微小，因此在針對單一學科或者單一知識點組織教學時應注重教學情景的融入，突出在線學習與自由學習。這一概念也逐漸被大眾所認可。資源建設方面，我國微課也尚未成型，目前的應用研究還相對零散，評價模式也有待完善。實現(xiàn)微課程的規(guī)范化發(fā)展還有很長的路要走。
二、細胞生物學實驗教學存在的問題
1.內容更新緩慢，亟待加強。我國的細胞生物學實驗教學一直處于教學滯后階段，僅僅作為理論教學的補充或者教學附屬而開設，缺乏關注上必然影響教學的創(chuàng)新與跟進，加上該實驗教學項目單一化趨勢嚴重，時代氣息不足，技術手段及知識的綜合運用十分缺乏，內容更新十分滯后。
2.教學方式單一化，學生自主性不足。細胞生物學實驗的基本流程就是提前由教師準備好實驗材料、實驗儀器及實驗試劑，學生在教師的示范引導下按部就班地進行實驗操作，整個操作過程趨于程式化、簡單化。學生不僅無法在實驗準備階段有所參與，更挫傷了學生創(chuàng)新與研究的積極性。
3.教學方法貧乏，缺乏對學生創(chuàng)新能力培養(yǎng)的關注。傳統(tǒng)的細胞生物學實驗教學受有限的教學時間的限制，因此實驗內容與要求也大多提前限定，教師單純地演示講解，學生被動地參與學習，雙方互動交流不足，教師也無法引導學生進行實驗的創(chuàng)新。
4.教學技術陳舊，現(xiàn)代教育技術參與較少。細胞生物學作為生物教學的前沿學科，理應注重教學的創(chuàng)新，特別是積極加入現(xiàn)代教育技術的創(chuàng)新元素，以信息技術為核心推動實驗教學。但是我國細胞生物學的教學現(xiàn)狀卻是現(xiàn)代教育技術十分欠缺，傳統(tǒng)實驗教學維度單一化趨勢嚴重。
三、微課在細胞生物學實驗中如何應用
1.微課的特性和優(yōu)勢，傳統(tǒng)多媒體教學的弊端：伴隨多媒體技術的迅猛發(fā)展及教學融入，部分教師開始嘗試運用多媒體輔助教學，但是當代大學生自由散漫的個性也成為多媒體輔助教學實施的制約因素，學生難以集中精力聽取教師講課，精品的視頻資源難以得到高效率的運用。應用于課后學習的視頻資料也難以受到學生的關注與重視，多數(shù)處于閑置。微課則突破了視頻教學的局限，具有普通視頻教學資源不具備的教學優(yōu)勢。首先，其教學內容濃縮，教學時間較短，借助移動端操作更為便捷，學生學習積極性顯著提升。其次，其教學主題十分明確，學生能夠迅速找到自己感興趣的點，從而獲得啟發(fā)教育或者延伸學習。最后，微課視頻的教學容量相對較小，符合學生的接受能力，學生更積極主動地參與到微課學習中去。
2.細胞生物學微課設計，把握10分鐘原則：注意力10分鐘。10分鐘內有明確的教學目標，內容短小，集中說明一個問題的小課程。微課設計ADDIE模型：A，分析;D，設計;D制作;I應用;E，評價。通常來說，微課設計要想保證自身的完整性必須具備6個基本環(huán)節(jié)，分別為教學主題的明確、前段分析、微課基礎知識點的切割與劃分、微課資源要素的重點設計、微課視頻錄制及后期加工處理、微課的最終終端輸出與展現(xiàn)。6個環(huán)節(jié)緊緊相扣，推動微課的高效開展。
四、微課引入實驗教學的意義與應用前景
微課具有廣闊的教育應用前景。2011年，手機將取代個人電腦成為個人信息中心。學生自帶設備BYOD，包括個人電腦、手機、上網(wǎng)本、平板等越來越普遍化。這為微課的實施提供了必備的硬件前提。調查中發(fā)現(xiàn)，84.44%的被調查者認可微視頻在微課教學中的核心地位與作用，并且70%以上的人認為配套的教學設計與課件也是不可忽視的部分?？v觀當前的教育改革，多數(shù)一線教師已經(jīng)充分認識到微課教學的魅力與優(yōu)勢，開始在課堂教學中嘗試微課教學。其中范福蘭等人在基于交互式微視頻教學資源教學應用效果的調查顯示，70.5%的學生認為交互式微視頻資源能夠激發(fā)他們對課程學習的興趣，單一的圖文及音視頻資源則受關注度一般，這也從側面說明隨著流媒體技術的發(fā)展成熟，微視頻的教學前景將是廣闊而光明的。
五、一些值得思考的問題
1.有關微課適用性，微課程在全國范圍內展開，帶來教學思想、教學模式的重大轉變，各個領域、各種培訓、不同學科對于微課程應用的嘗試存在“泛用”、“濫用”現(xiàn)象。微課程適用于哪些領域、哪些課程、哪些內容以及熒光怎樣設計、怎樣制作、怎樣使用才是最科學合理的成為今后科學研究的新課題。
2.細胞生物學實驗微課應用存在問題，我國針對該專業(yè)的微課理論研究及實踐演練依然不足，多數(shù)高校在微課開展實施的過程中存在建多用少的資源浪費現(xiàn)象。因此必須將微課作為校本研修資源，對其加強引導宣傳，讓教師認可微視頻教學的優(yōu)勢并拓展專業(yè)發(fā)展的新途徑。此外微課程應奠定創(chuàng)新型教學模式的資源基礎，以期為學生提供更實用的教學資源，做好教學輔助。當然微課作為新興教學理念，應該在移動學習與泛在學習的基礎上實現(xiàn)教學需求與教學實踐的同步發(fā)展，最大限度提升微課程的開展利用率。
六、總結
微課作為新興的教學模式理應受到關注，了解微課的本質內涵，在梳理其優(yōu)勢與缺陷基礎上綜合當前的運用實際，科學預測并規(guī)劃后期發(fā)展，實現(xiàn)微課在設計開發(fā)與應用上的創(chuàng)新完善。本文就微課教學的幾點問題進行了歸納分析，以期為微課教學的拓展應用提供有效思路，讓微課的魅力更多地展現(xiàn)出來，服務于高校教學。
1.課程設置合理化
研究生課程體系的設置做到適時調整，豐富選課資源的同時，加強學生選課的自主性，充分考慮學生的個性化培養(yǎng)的需求。
2.優(yōu)化教學內容
創(chuàng)新型人才培養(yǎng)模式改革首要是課程改革，而課程改革首先要解決的問題是教學內容的優(yōu)化。研究生創(chuàng)新能力的培養(yǎng)應該是建立在知識、能力、素質的辯證統(tǒng)一的基礎上。知識作為能力和素質的載體，是不可或缺的重要一環(huán)，研究生階段知識的獲取不應該局限于本科階段的某一本教材的重復拓展。我們在課堂設計中集思廣益，打破教材的局限，以學生興趣為出發(fā)點，設置了十個小的專題題目，專題內容涉及細胞生物學的基本技術及其創(chuàng)新、前沿知識、熱點領域，并充分考慮細胞生物學與醫(yī)學的密切關系。如細胞通訊、細胞信號跨膜轉導及其與疾病的關系，端粒、端粒酶和腫瘤的關系及其研究進展，細胞骨架與運動和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關系舉例（原因分析、分子細胞學調整、研究進展）等。學生既能從中鞏固提煉的基本理論框架，又能獲得豐富的前沿信息，在學習中還有助于科研方向的確立和科研思維的培養(yǎng)。
3.改革教學方法
我們在前幾年的教學中留心對研究生的理論基礎、能力水平和喜歡的教學模式做了問卷調查，相對于本科生研究生階段學生的特點突出表現(xiàn)為：已經(jīng)具有比較廣泛、系統(tǒng)的理論知識基礎，并具備一定的分析問題的能力，更向往自由的思維和互動表達。綜合研究生的特點和現(xiàn)代教育技術的發(fā)展，我們在課堂教學中試行教學方法改革，徹底改變教師灌輸知識的單一模式，更多地讓學生自主學習，教師擔負引導、組織實施、總結和考評的職責，更多的時候也是討論和爭論的主體之一，變師徒關系為伙伴關系。具體實施是依據(jù)學生興趣分組，3~4人/組，組內分工協(xié)作，依據(jù)自己所選的感興趣的專題查閱資料，開展討論并推舉一人以PPT文稿的形式圖文結合在課堂上匯報講解，同學可以自由提問，教師做針對性的點評、補充。創(chuàng)新的課堂組織從學生的興趣出發(fā)保障了自主學習的效率，協(xié)作中鍛煉了學生的團隊意識和合作能力，課堂表達和提問互動有效地活躍了學習氣氛，調動了學習的積極性，并提高了學生綜述及表達能力。此種形式受到了選課學生的一致好評，也吸引了更多的研究生加入我們的學習隊伍中。
4.考評手段合理化
在轉變教師單向傳授知識模式的同時，打破以考試分數(shù)作為衡量教育成果的唯一標準的劃一呆板的考評制度。對學生學習的評價主要是課堂表現(xiàn)和實踐實訓，各占50%。課堂表現(xiàn)的評價中以小組匯報講解中的綜合能力表現(xiàn)作為主要的考評指標，并逐步完善了評分標準，簡介如下：基本原理簡明扼要、切中要點、通俗易懂；研究應用舉例典型、兼顧多方面；重視結果分析（盡量使用圖表）；重視技術發(fā)展的進展和研究理論進展（突出新意）。除了陳述者有獎勵分之外，課堂提問及回答者都有酌情加分，極大地調動了學生的積極性。學生課前準備、課堂提問、課后總結的學習資料都可以組織建立個人學習檔案，學習檔案也可作為酌情加分的因素。
二、反饋與思考
教學內容、教學方法及新的考評方法改革的突出優(yōu)勢在于愛護和培養(yǎng)學生的好奇心、求知欲，幫助學生自主學習，獨立思考，保護學生的探索精神、創(chuàng)新思維，營造崇尚真知、追求真理的氛圍，為學生的稟賦和潛能的充分開發(fā)創(chuàng)造一種寬松的環(huán)境。讓學生感受、理解知識產(chǎn)生和發(fā)展的過程，培養(yǎng)學生的科學精神和創(chuàng)新思維，重視培養(yǎng)學生收集處理信息的能力，獲取新知識的能力，分析問題和解決問題的能力，語言文字表達以及團結協(xié)作能力。但在試行新的教學方法的同時，我們也發(fā)現(xiàn)了一些有待于改進的問題。在課程體系的設置中需要合理調研，依據(jù)社會、培養(yǎng)目標和學生主體的需求做出調整，充分適應多學科交叉融合的需求。在教學內容的優(yōu)化上，學生更注重研究進展的討論和熱點文獻的分析，教學內容需要每年更新，不能一成不變。在教學方法改革中，試行討論式課堂的問題反應在四個方面：個別小組成員因自制力不強、計算機水平限制、口頭表達能力欠缺等原因對所選專題的基本理論或研究進展陳述不清楚，會一定程度上影響其他同學對該專題領域的學習。在課堂匯報環(huán)節(jié)，受部分同學表達能力的影響，學生的注意力不容易集中，課堂進展的節(jié)奏會略顯拖沓。在教學過程中容易出現(xiàn)兩極分化的現(xiàn)象，部分學生的主動性得到了很好的發(fā)揮，綜合能力得到了比較充分的鍛煉，也有個別學生在混學分，并沒有進行真正的自主學習。且教師對新的教學方法的理解和掌握的程度也一定程度上影響了學生的學習效果。在評價體系中，給學生公正、全面、合理的評價影響著學生的學習態(tài)度和熱情，但其過程是相當煩瑣的，需要教師團隊比較多的精力投入，適當?shù)募顧C制能更好地配合教學改革的推進。
三、展望
采用MTT法繪制細胞生長曲線。取第7代近融合的腸上皮細胞,消化后調整細胞密度為1×105/mL的單細胞懸液,接種于96孔板中,每孔接種100μL,接種15板,每3d更換一次細胞培養(yǎng)液。每天于相同時間取出一板細胞,每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL,培養(yǎng)4h后,吸出孔內上清,每孔加入二甲基亞砜150μL,震蕩10min后于酶聯(lián)免疫檢測儀以490nm波長測吸收值。共測定15d,以時間作為橫坐標,光吸收值(D)作為縱坐標,繪制細胞生長曲線。1.8流式細胞術(flowcytometry,FCM)分析細胞周期常規(guī)方法收集第7代近融合的腸上皮細胞,PBS洗滌2次,在離心管中留約0.5mL的PBS,向細胞懸液中緩慢加入75%冰乙醇,–20°C固定過夜。檢測前,1000r/min離心3min去除乙醇,PBS清洗1次,加入適量碘化丙啶染液(0.1%TritionX-100,10μg/mL碘化丙啶,50μg/mLRNase),室溫避光染色30min,上機檢測,計數(shù)10000個細胞,用MuticycleAV軟件進行DNA細胞周期擬合分析。增殖指數(shù)(proliferativeindex,PI)指增殖細胞占總周期細胞的比例,S期細胞指數(shù)(S-phasefraction,SPF)指細胞周期中處于S期細胞所占的比例。采用PI和SPF分析細胞的增殖活性,PI(%)=(S+G2/M)/(S+G2/M+G0/G1)×100%,SPF(%)=S/(G0/G1+S+G2/M)×100%。1.9染色體核型分析參考已報道的方法[13],稍作修改。傳代細胞以1×105/mL的密度接種至96孔板。48h后換液,給予濃度為2μg/mL秋水仙素處理3h;消化收集細胞,37°C低滲(0.075mol/LKCl)處理20min;用新鮮配制(4°C預冷)的卡諾固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)預固定20min,離心去除上清,再視細胞量加入新鮮固定液0.5~1mL,以移液槍重懸沉淀;取出–20°C預冷的玻片,30cm高度滴片;空氣干燥,吉姆薩工作液染色10min,脫色,在顯微鏡下選擇分散良好,形態(tài)清晰的染色體中期分裂相,進行拍照,用Photoshop軟件進行染色體核型分析。
2結果
2.1IEC-P.A.的細胞形態(tài)與超微結構
用嗜熱菌蛋白酶和I型膠原酶聯(lián)合消化參環(huán)毛蚓腸組織,獲得的大量隱窩單位和散在細胞。隱窩單位培養(yǎng)48h即能貼壁,72h開始輻射出零星細胞;而散在的腸上皮細胞貼壁所需時間較長,接種一周才可形成少量的細胞集落(圖1A),15d開始貼壁,但附著不穩(wěn)定,稍振動即浮起。約28~30d細胞生長至85%~90%匯合,可進行傳代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)時有較多的細胞碎片,且上皮細胞與成纖維細胞夾雜生長,傳至第3代以后,細胞碎片明顯減少,類圓形上皮細胞數(shù)量增多,形態(tài)較一致。傳代后細胞生長穩(wěn)定,培養(yǎng)13~15d可見腸上皮細胞匯合成細胞單層,呈典型“鋪路石樣”鑲嵌排列,邊界清晰,互不重疊(圖1B)。透射電鏡下觀察培養(yǎng)的腸上皮細胞,可見細胞結構完整,直徑為8±2μm,具有典型的腸上皮隱窩細胞特征。微絨毛從細胞表面伸出,排列整齊(圖2A),近絨毛端胞質中分布豐富的線粒體,其嵴清晰可見(圖2B),細胞核周區(qū)域有大量的粗面內質網(wǎng)(圖2C)。
2.2IEC-P.A.的生長曲線
第7代參環(huán)毛蚓腸上皮細胞的生長曲線見圖3,體外培養(yǎng)的腸上皮細胞存在著明顯的潛伏期,接種培養(yǎng)7~9d后才能進入對數(shù)生長期,經(jīng)過大約4d的對數(shù)生長期后,至13~15d開始進入平臺期,且能相對較長時間維持在這一時期。
2.3FCM分析IEC-P.A.細胞周期
參環(huán)毛蚓腸上皮細胞的細胞周期檢測結果見圖4,細胞各個時期的分布狀態(tài)是G0/G1期為(93.13±0.12)%,S期為(3.73±0.23)%,G2/M期為(3.14±0.17)%,細胞的增殖活性指標PI為6.87%,SPF為3.73%。由此可見,體外培養(yǎng)的腸上皮細胞接種后,相對較長時間處于靜止期,尚未進行增殖分裂活動。
2.4IEC-P.A.染色體核型分析
本實驗所培養(yǎng)的腸上皮細胞來源于環(huán)節(jié)動物門的參環(huán)毛蚓,具有一定的特殊性,與常規(guī)哺乳動物的細胞差異較大。處于中期分裂相的腸上皮細胞所占比例較少,且處于分散狀態(tài)的染色體臂常常出現(xiàn)部分重疊(圖5A),但尚可應用Photoshop軟件進行核型分析。根據(jù)所拍攝的20個細胞的中期分裂相,可以得出,參環(huán)毛蚓腸上皮細胞的染色體數(shù)為2n=22,其中第1、2、5、8、9、11號染色體為中部著絲粒染色體,第4、7、10號染色體為亞中部著絲粒染色體,第3、6號染色體為亞端部著絲粒染色體,其染色體核型可表示為n()=x=6m+3sm+2st(圖5、表1)。整體來說,第3代參環(huán)毛蚓腸上皮細胞染色體沒有異常表現(xiàn),基因組相對穩(wěn)定。
3討論
體外培養(yǎng)的腸上皮細胞對于研究營養(yǎng)物質的吸收代謝機制、藥物作用以及各種致病因素作用下的生理病理改變具有重要意義,所取得的研究成果可以為人工養(yǎng)殖活動提供科學指導,從而帶來巨大的經(jīng)濟效益[14]。目前,蚯蚓種屬腸上皮細胞培養(yǎng)與生物學特性研究尚未見報道。本研究采用混合酶消化法對參環(huán)毛蚓腸上皮細胞進行分離培養(yǎng),穩(wěn)定傳至第8代,并研究了細胞形態(tài)、超微結構、生長曲線、細胞周期和染色體核型等生物學特性,成功獲得參環(huán)毛蚓腸上皮細胞系(IEC-P.A.)。不僅豐富了環(huán)節(jié)動物門的細胞資源及相關生物學特性資料,而且所建立的細胞培養(yǎng)技術及生物學特性檢測方法可以為蚯蚓種屬細胞培養(yǎng)及研究提供參考。分離腸上皮細胞常用的消化酶包括胰蛋白酶、膠原酶、嗜熱菌蛋白酶及中性蛋白酶。由于來源動物不同,關于各種消化酶的分離效果有不同的報道,其中嗜熱菌蛋白酶分離腸上皮細胞可獲得大量的健全絨毛隱窩單位,且傳代后增殖能力比較穩(wěn)定[15-17]。本實驗參考上述條件,對消化酶進行了適當調整,篩選確定嗜熱菌蛋白酶和I型膠原酶的混合酶液較適合分離參環(huán)毛蚓的腸上皮細胞。所得細胞懸液可見大量腸上皮細胞特有的隱窩單位。細胞鑒定是腸上皮細胞培養(yǎng)過程中一個重要內容。除了觀察形態(tài)特征外,常用的有堿性磷酸酶染色法、電鏡法及免疫熒光染色法[18]。由于堿性磷酸酶染色法影響因素復雜,陽性率低;又因親緣性的關系,參環(huán)毛蚓腸上皮細胞缺少特異性標記物,而無法使用免疫學鑒定,所以本研究選取了透射電鏡觀察參環(huán)毛蚓腸上皮細胞的超微結構。細胞表面可見大量微絨毛,胞內含有豐富的線粒體、粗面內質網(wǎng),符合腸上皮細胞的特征。應用流式細胞技術,對核酸染料標記的DNA進行檢測,能夠得到細胞各個時期的分布狀態(tài),通過計算G0/G1、S、G2/M期的百分數(shù),可以進行細胞周期分析,了解細胞的增殖能力[19]。常規(guī)測定時多選用碘化丙啶染料對DNA染色,但本實驗中發(fā)現(xiàn)碘化丙啶不能對75%冰乙醇固定的參環(huán)毛蚓腸上皮細胞的DNA進行染色。分析其原因可能是碘化丙啶無法進入?yún)h(huán)毛蚓的細胞內所致。為此,本團隊通過添加不同濃度TritionX-100進行破膜,最終選取的染色液組分為0.1%TritionX-100、10μg/mL碘化丙啶、50μg/mLRNase,使FCM分析參環(huán)毛蚓IEC細胞周期的檢測得以順利進行。但結果中變異系數(shù)(coefficientofvariation,CV)值、細胞碎片含量(%Debris)較高,表明此破膜染色方法還有待于進一步優(yōu)化。S期細胞比率(SPF)和增殖指數(shù)(PI)均可以反映細胞群體的增殖狀態(tài)和DNA的合成速度,因此常用它們的大小來表示細胞增值活性的高低[20]。
細胞凋亡采用FITC-PI雙染色方法檢測。制備轉染后的GSCs細胞懸液，每管加入10μLFITC溶液，避光孵育30min后，每管加入10μLPI溶液，C6流氏細胞儀每管抽取10000個細胞進行分析。實驗重復6次。細胞遷移及侵襲能力采用Transwell小室方法檢測。制備轉染后的GSCs細胞懸液，以每孔100μL含51×10細胞數(shù)接種于Transwell小室的上室，下室加入500μL高糖DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），48h后取出小室，PBS清洗上室內的細胞，室溫晾干后4%多聚甲醛固定30min，PBS清洗3遍，至于吉姆薩染色液中染色30min，取出室溫晾干后，置于顯微鏡直接觀察拍照，隨機選取5個視野計數(shù)染色細胞個數(shù)。細胞侵襲能力檢測需在Transwell小室的上室內預先鋪置基質膠，置37℃、5%CO細胞培養(yǎng)箱中26h后備用，余步驟與細胞遷移實驗相同。實驗重復6次。統(tǒng)計分析用SPSS18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理。實驗數(shù)據(jù)用表示，兩組間采用t檢驗，多組間采用單因素方差分析和Bonferroni檢驗，<0.05認為有統(tǒng)計學差異。
2結果
2.1U87來源的GSCs的鑒定
如圖1A所示，U87細胞置于干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)后形成細胞球，此細胞球同時表達Nestin（神經(jīng)干細胞標志物）及CD133（腫瘤干細胞標志物），在圖1B中，細胞球在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中進行分化培養(yǎng)2周后，細胞表達膠質細胞活化的典型標志物GFAP，以及神經(jīng)元的典型標志物tubulinIII。以上結果說明在干細胞培養(yǎng)基形成的細胞球細胞為典型的膠質瘤干細胞，具有神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤干細胞的特征，并且具有多向分化能力。
2.2在GSCs中，miR-144呈現(xiàn)低表達狀態(tài)
如圖2所示，Real-timePCR結果顯示，與non-GSCs相比，在GSCs中miR-144的表達明顯降低（<0.01），說明miR-144可能參與了腦膠質瘤的發(fā)生和發(fā)展。
2.3轉染后，miR-144的表達
如圖3所示，在pre-miR-144組中，miR-144的表達顯著提高（<0.01），而在anti-miR-144組中，miR-144的表達顯著降低（<0.01）。
2.4過表達miR-144降低GSCs的細胞活力
如圖4所示，在pre-miR-144組中，GSCs的細胞活力顯著降低（<0.01），而在anti-miR-144組中，GSCs的細胞活力顯著提高（<0.01），但是在pre-NC組和anti-NC組中，GSCs的細胞活力與對照組比較無統(tǒng)計學差異。
2.5過表達miR-144促進GSCs凋亡
如圖5所示，在pre-miR-144組中，GSCs的細胞凋亡率顯著增加至15.6%（<0.01），而在anti-miR-144組中，GSCs的細胞凋亡率顯著下降到3.6%（<0.01）。但是在對照組，pre-NC組和anti-NC組中細胞凋亡率分別為8.1%，7.9%和7.9%，三組間無統(tǒng)計學差異。
2.6過表達miR-144抑制GSCs的細胞遷移及侵襲
如圖6所示，在pre-miR-144組中，細胞的遷移能力顯著降低（<0.01），而在anti-miR-144組中，細胞的遷移能力顯著提高（<0.01）。但是在pre-NC組和anti-NC組中，細胞遷移能力與對照組比較無統(tǒng)計學差異。此外，在細胞的侵襲能力檢測中，我們得到了相似的結果。
2.7MiR-144靶基因的預測
如圖7所示，我們經(jīng)過查閱生物信息學預測軟件Targetscan、Pictar和RNAhybrid等，發(fā)現(xiàn)有眾多基因存在miR-144的結合位點，經(jīng)查閱文獻得知其中X染色體連鎖鋅指轉錄因子（ZFX）和酪氨酸激酶受體（TEK）與GSCs的發(fā)生展有著密切的關系。
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