時(shí)間：2023-09-18 17:04:09
序論：在您撰寫(xiě)基因治療的基本策略時(shí)，參考他人的優(yōu)秀作品可以開(kāi)闊視野，小編為您整理的7篇范文，希望這些建議能夠激發(fā)您的創(chuàng)作熱情，引導(dǎo)您走向新的創(chuàng)作高度。
關(guān)鍵詞：硝苯地平；不良反應(yīng)；牙齦增生
目前鈣離子通道拮抗劑作為治療高血壓、緩解心絞痛的常用藥，以其價(jià)格低廉、療效顯著及相對(duì)安全，在臨床中被廣泛應(yīng)用。其常見(jiàn)的不良反應(yīng)如：低血壓、心動(dòng)過(guò)速、顏面潮紅、外周水腫、充血性心衰等，而近年來(lái)一些少見(jiàn)不良反應(yīng)，尤其是該類藥物導(dǎo)致牙齦增生的報(bào)道相繼出現(xiàn)，逐漸引起臨床醫(yī)生的重視[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在鈣離子拮抗劑中，硝苯地平所致牙齦增生最為常見(jiàn)。本文就臨床觀察到的1例服用硝苯地平后出現(xiàn)牙齦增生的病例進(jìn)行探討。
1 資料與方法
1.1一般資料 將我院2015年3月接收1例服用硝苯地平患者出現(xiàn)牙齲增生者作為調(diào)查對(duì)象，馮某，男，44歲，高血壓病10余年，最高血壓170/120 mmHg，服用硝苯地平10 mg，1次/ d 3年余，查體：一般情況可，血壓110/90 mmHg，心率70次/min，雙側(cè)牙齦增生，心肺腹查體陰性，雙下肢對(duì)稱性指凹性水腫。診斷：高血壓病3級(jí)（極高危）鈣離子拮抗劑所致雙下肢水腫及牙齦增生，見(jiàn)圖1。
圖1 牙齦增生
1.2方法 停用硝苯地平，更換降壓藥為替米沙坦40 mg Qd美托洛爾23.75 mg Qd及短期應(yīng)用利尿劑。
2 討論
硝苯地平引起牙齦增生的發(fā)病率，國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道為14%～83%，國(guó)內(nèi)有文獻(xiàn)報(bào)道為20.8%，通常表現(xiàn)為牙齦邊緣和牙齦增生，質(zhì)地堅(jiān)韌、略有彈性，無(wú)痛，一般不出血，但多數(shù)患者會(huì)伴有牙齦炎癥，出現(xiàn)牙齦出血、松軟和顏色的改變[2]。
目前，硝苯地平致牙齦增生發(fā)病的分子及細(xì)胞學(xué)機(jī)制尚不十分明確，主要與膠原代謝紊亂、激素、炎癥與免疫反應(yīng)等有關(guān)，且其發(fā)病可能與多種易感因素有關(guān)，如遺傳因素、個(gè)體易感性、用藥劑量、療程、菌斑指數(shù)及牙齦炎癥、性別、年齡等，其中研究發(fā)現(xiàn)，不同人群對(duì)硝苯地平的反應(yīng)不同，發(fā)生牙齦增生亦因人而異，即可能分為硝苯地平牙齦敏感型及硝苯地平牙齦耐受型，且用藥劑量越大、用藥療程越長(zhǎng)，其發(fā)生率越高，病變?cè)街?。亦有研究發(fā)現(xiàn)，口腔衛(wèi)生條件差、菌斑指數(shù)高可加重牙齦炎癥，是引起牙齦增生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，一般男性的發(fā)病率高于女性，大致為女性的3倍，考慮可能與硝苯地平阻止鈣離子內(nèi)流，使細(xì)胞外鈣離子堆積，刺激局部雄性激素的代謝，從而促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖或使膠原酶釋放減少有關(guān)，另有研究提示其發(fā)病率與年齡呈負(fù)相關(guān)，年齡越小發(fā)病率越高，隨著年齡增長(zhǎng)，其發(fā)病率降低[3-6]。
藥物性牙齦增生的治療，首先是停用可能有影響的藥物，最好更換為其他類型降壓藥，大多數(shù)患者停藥后數(shù)月內(nèi)可自行緩解，對(duì)血壓控制不好，無(wú)法停藥的患者，最好采用聯(lián)合用藥，減少單藥用藥劑量，也能一定程度減少其發(fā)病率。對(duì)于一些中重度牙齦增生，還可就診于口腔科，行牙周治療，如菌斑控制、齦上潔治和齦下刮治、根面平整等，對(duì)于嚴(yán)重牙齦增生的患者還可行手術(shù)切除，然而該治療僅為短暫緩解，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，尤其是對(duì)于未停藥、口腔衛(wèi)生條件差或缺乏口腔護(hù)理的患者，因此保持良好的口腔衛(wèi)生、定期行專業(yè)的口腔清潔、控制牙菌斑亦為重要的治療方案[7-10]。
綜上，藥物性牙齦增生不僅影響咀嚼功能，同時(shí)會(huì)影響美觀、加重牙齦炎癥、產(chǎn)生口腔異味等，也有研究發(fā)現(xiàn)牙周疾病的慢性感染過(guò)程能夠影響心血管系統(tǒng)，最終將形成惡性循環(huán)，不利于高血壓與冠心病的治療，故這一問(wèn)題應(yīng)該引起臨床醫(yī)生的重視，深入研究其發(fā)病機(jī)制，尋找更多更有效的治療方案。
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關(guān)鍵詞：基本醫(yī)療 醫(yī)保費(fèi)用 增長(zhǎng) 控制
目前我國(guó)基本醫(yī)療保險(xiǎn)已經(jīng)覆蓋12.95億人，覆蓋95%以上人口。隨著我國(guó)醫(yī)療衛(wèi)生體制的改革，覆蓋面已經(jīng)基本涵蓋了城鎮(zhèn)居民、農(nóng)民及外出打工人群。人們?cè)谙硎茚t(yī)療保險(xiǎn)帶給我們醫(yī)療保障的同時(shí)，醫(yī)療費(fèi)用的快速上漲，也給醫(yī)?；饚?lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。因此，若何有效控制醫(yī)療保險(xiǎn)費(fèi)用的過(guò)快增長(zhǎng)，是醫(yī)療保險(xiǎn)制度健康、有序、穩(wěn)步發(fā)展的前提，是保障人民群眾健康的物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)，也是醫(yī)療保險(xiǎn)事業(yè)平穩(wěn)運(yùn)行的基石。本文結(jié)合醫(yī)療保險(xiǎn)管理的實(shí)際，對(duì)我國(guó)醫(yī)療保險(xiǎn)運(yùn)行機(jī)構(gòu)如何控制醫(yī)療保險(xiǎn)費(fèi)用的過(guò)快增長(zhǎng)進(jìn)行分析和探討。
一、醫(yī)療費(fèi)用過(guò)快增長(zhǎng)的原因分析
引起次均醫(yī)療費(fèi)用和就醫(yī)頻率增加的因素很多，從對(duì)部分省份醫(yī)療基金運(yùn)行的實(shí)際情況分析，主要影響因素包括以下方面：
（一）正常醫(yī)療需求的增加。
一方面，基本醫(yī)療保險(xiǎn)制度從無(wú)到有，居民生活水平不斷提高，使人們的醫(yī)療需求得以正常釋放，直接影響到了就醫(yī)頻率的增加。同時(shí)，2009年開(kāi)始，各統(tǒng)籌地區(qū)為了合理控制醫(yī)療保險(xiǎn)統(tǒng)籌基金的結(jié)余規(guī)模，分階段、不同程度地對(duì)本統(tǒng)籌地區(qū)醫(yī)療保險(xiǎn)待遇政策進(jìn)行了調(diào)整。例如：提高醫(yī)療保險(xiǎn)統(tǒng)籌基金年度最高支付限額和共付段醫(yī)保基金支付比例、增設(shè)門(mén)診大病病種等。在降低參保人員個(gè)人負(fù)擔(dān)的同時(shí)，提升了參保人員的就醫(yī)意愿，從而影響到了就醫(yī)頻率的增加。
另一方面，我國(guó)城鎮(zhèn)職工參保人群年齡結(jié)構(gòu)處于一個(gè)逐漸老化的趨勢(shì)中，各種慢性疾病、危重病發(fā)生概率增加，直接導(dǎo)致就醫(yī)頻率和次均費(fèi)用的增加。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，退休人員的次均門(mén)診費(fèi)用與在職人員差別不大，次均住院費(fèi)用、門(mén)診就診率和住院率卻差別明顯。
（二）以量補(bǔ)價(jià)的過(guò)度醫(yī)療現(xiàn)象普遍存在，推動(dòng)醫(yī)療費(fèi)用大幅增加。
受?chē)?guó)家價(jià)格政策因素的影響，醫(yī)療機(jī)構(gòu)通過(guò)提高醫(yī)療收費(fèi)項(xiàng)目?jī)r(jià)格的創(chuàng)收途徑受到制約，同時(shí)又由于我國(guó)絕大部分統(tǒng)籌地區(qū)均采用項(xiàng)目付費(fèi)的結(jié)算方式，刺激了各醫(yī)療機(jī)構(gòu)通過(guò)增加醫(yī)療服務(wù)提供量和種類來(lái)創(chuàng)收。以量補(bǔ)價(jià)的過(guò)度醫(yī)療情況已成為我國(guó)醫(yī)療費(fèi)用不合理支出快速增加的重要原因。
（三）先進(jìn)醫(yī)療技術(shù)在臨床推廣，對(duì)高級(jí)別醫(yī)院的次均費(fèi)用影響較大。
隨著科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，新的醫(yī)療儀器設(shè)備、藥品和診療技術(shù)層出不窮，極大地提高了診療水平，在解決疑難雜癥方面起到了重要作用。與此同時(shí)，醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，其本身的高科技價(jià)值也帶來(lái)了醫(yī)療費(fèi)用的攀升。
二、控制醫(yī)療費(fèi)用上漲的應(yīng)對(duì)措施
醫(yī)療衛(wèi)生資源的有限性與醫(yī)療服務(wù)需求的不斷膨脹之間的矛盾，醫(yī)療保險(xiǎn)籌資與支出之間的矛盾，醫(yī)療保險(xiǎn)支出與積累之間的矛盾，是關(guān)系到社會(huì)保險(xiǎn)事業(yè)持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。根據(jù)醫(yī)療費(fèi)用上漲的特點(diǎn)，在保障醫(yī)療需求合理增加的前提下，結(jié)合電力行業(yè)實(shí)際，應(yīng)從以下幾方面采取措施，控制醫(yī)療費(fèi)用的快速上漲。
（一）加大醫(yī)保政策宣傳力度。
我國(guó)現(xiàn)行的是“低水平、廣覆蓋、?；尽钡尼t(yī)療保障制度和“以收定支、收支平衡、略有結(jié)余”的基金管理原則。醫(yī)保部門(mén)應(yīng)加強(qiáng)醫(yī)保政策的宣傳，使參保人員明白基本醫(yī)療保險(xiǎn)保的是基本醫(yī)療，而不是特需醫(yī)療。基本醫(yī)療就是因病施治，進(jìn)行合理的檢查、用藥及治療。不根據(jù)病情需要，盲目要求醫(yī)生多開(kāi)藥、開(kāi)貴藥，不僅不能對(duì)癥治療，還會(huì)給自己和醫(yī)?；鹪斐衫速M(fèi)。
（二）加強(qiáng)政策引導(dǎo)，合理分流病人。
建立雙向轉(zhuǎn)診制度，合理分流參保人員到適合自身疾病治療的相應(yīng)級(jí)別醫(yī)院就醫(yī)。為促使雙向就診制度的有效實(shí)施，醫(yī)療保險(xiǎn)經(jīng)辦機(jī)構(gòu)應(yīng)積極主動(dòng)延伸服務(wù)，一方面將各定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)收治的各類常見(jiàn)病的治愈率、次均醫(yī)療費(fèi)用、平均住院天數(shù)、個(gè)人負(fù)擔(dān)、病人滿意度等多種信息定期對(duì)外公布；另一方面，對(duì)我國(guó)醫(yī)技高超、醫(yī)德高尚的醫(yī)務(wù)工作者，醫(yī)療保險(xiǎn)經(jīng)辦機(jī)構(gòu)可以主動(dòng)進(jìn)行宣傳，盡量減少病人和醫(yī)院之間的信息不對(duì)稱程度。
（三）實(shí)施醫(yī)療保險(xiǎn)定點(diǎn)醫(yī)生管理制度，強(qiáng)化醫(yī)務(wù)人員的自律性。
隨著我國(guó)五險(xiǎn)合一的金保工程二期信息系統(tǒng)在部分地區(qū)范圍內(nèi)逐步推廣使用，對(duì)醫(yī)療保險(xiǎn)定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)精確化管理程度提高，管理落實(shí)到醫(yī)生的條件已基本成熟。可以建立部分地區(qū)醫(yī)療保險(xiǎn)定點(diǎn)醫(yī)生庫(kù)，制定定點(diǎn)醫(yī)生誠(chéng)信評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)和激勵(lì)機(jī)制，建議全國(guó)各省份人力資源和社會(huì)保障管理部門(mén)將醫(yī)保定點(diǎn)醫(yī)生的誠(chéng)信狀況作為醫(yī)生職稱評(píng)定的標(biāo)準(zhǔn)之一，提升醫(yī)生提供醫(yī)療服務(wù)的自律性。
（四）加強(qiáng)醫(yī)保稽核管理，確保基金安全。
加強(qiáng)醫(yī)?；斯芾恚哟髮?duì)違規(guī)行為的查處力度，對(duì)參保人員將醫(yī)療卡、證轉(zhuǎn)借他人使用，惡意騙取醫(yī)保基金等各種違規(guī)行為，要加大查處打擊力度，以此強(qiáng)化就醫(yī)管理，促使參保人員規(guī)范就醫(yī)行為。如：把醫(yī)保稽核作為醫(yī)保工作重心之一，通過(guò)加強(qiáng)對(duì)監(jiān)管，有效遏制分解住院、降低入院標(biāo)準(zhǔn)、掛床、冒名住院、虛擬住院、過(guò)度治療等不規(guī)范醫(yī)療服務(wù)行為，促進(jìn)醫(yī)療服務(wù)質(zhì)量的提高，維護(hù)參保人的權(quán)益。
（五）完善醫(yī)療保險(xiǎn)定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)管理質(zhì)量評(píng)價(jià)機(jī)制，實(shí)施定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)分級(jí)管理。
通過(guò)實(shí)施定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)分級(jí)管理，進(jìn)一步改進(jìn)定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)年度考核指標(biāo)，并建立定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)管理激勵(lì)和約束機(jī)制，變被動(dòng)管理為主動(dòng)管理。
雖然腫瘤的基因治療在整個(gè)基因治療的臨床方案中占63％以上，但迄今為止在臨床上仍無(wú)重大突破。這是由于基因治療缺乏靶向性，基因的轉(zhuǎn)染率和表達(dá)量都很低。同樣用病毒治療惡性腫瘤也成為研究的熱點(diǎn)，如腺病毒ONYX－015、CV706，雖然也取得了某些進(jìn)展，但沒(méi)有重大突破，其原因是病毒治療雖有靶向性，轉(zhuǎn)染率也不低，但殺傷率較小。為此，我們提出癌癥的靶向基因一病毒治療策略，即以溶瘤病毒作為基因的表達(dá)載體(所謂溶瘤病毒即病毒只特異性地在腫瘤中復(fù)制而在正常細(xì)胞中不復(fù)制)，將溶瘤病毒治療與基因治療各自的優(yōu)勢(shì)相結(jié)合。其療效既比單用基因治療好，也比單用病毒治療好，是今后基因治療與病毒治療的新趨勢(shì)。目前，圍繞此策略開(kāi)展的一系列研究工作，正在不斷深入之中。
癌癥的靶向基因――病毒治療
這一策略的基本方法是：將腫瘤特異性增殖病毒(溶瘤病毒)作為載體，在其中插入抗癌基因。我們使用的是經(jīng)過(guò)改造的腺病毒載體，它可特異性地導(dǎo)向腫瘤，本身就有一點(diǎn)治療作用，而且可特異性地在腫瘤中復(fù)制數(shù)百至數(shù)千倍，使所攜帶的基因也能特異性地在腫瘤中增殖數(shù)百至數(shù)千倍。
【關(guān)鍵詞】口腔鱗狀細(xì)胞癌；腫瘤；免疫基因治療；綜述
【中圖分類號(hào)】R739.8 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1004-4949（2014）03-0456-01
1 口腔鱗狀細(xì)胞癌簡(jiǎn)介
口腔鱗狀細(xì)胞癌是頭頸部最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其好發(fā)部位依次為舌、牙齦、頰、腭、唇、口底。鱗狀細(xì)胞癌以角化珠形成及出現(xiàn)細(xì)胞間橋?yàn)椴±韺W(xué)特征。腫瘤來(lái)自表面口腔黏膜上皮，腫瘤性上皮團(tuán)或上皮島浸潤(rùn)下方結(jié)締組織，細(xì)胞特征可表現(xiàn)為豐富的嗜酸性胞質(zhì)，胞核、核漿比大，程度不同的細(xì)胞及胞核的多形性，鱗狀上皮形成的角化珠和單細(xì)胞的角化均可見(jiàn)。OSCC占口腔頜面部癌瘤80%以上，患者5年生存率約為50%，對(duì)于腫瘤晚期和復(fù)發(fā)患者，生存率更低[1]。因此尋找有效的治療方法十分重要。經(jīng)過(guò)過(guò)去幾十年的發(fā)展，手術(shù)、放療及化療并沒(méi)有顯著提高口腔癌患者的生存率，化療藥物有明顯的副作用，而且對(duì)復(fù)發(fā)的口腔癌患者生存率的影響尚不明確。研究新的治療方法顯得尤為關(guān)鍵。
許多研究表明：惡性腫瘤的治療中，免疫治療一直走在前沿，口腔癌患者特別是鱗癌患者，其細(xì)胞免疫功能早期就不同程度地受到傷害，再加上常規(guī)治療方法（手術(shù)、放療、化療等）又可導(dǎo)致機(jī)體免疫功能的進(jìn)一步下降。因此，口腔癌腫的最佳治療策略應(yīng)是包括免疫治療在內(nèi)的綜合療法。隨著人類基因組計(jì)劃的完成和口腔鱗癌發(fā)病功能基因的不斷探明，腫瘤基因治療這一生物治療手段越來(lái)越受到大家的認(rèn)可。自從1988年Rosenberg[2]提出要將腫瘤免疫基因治療原理實(shí)際應(yīng)用于臨床起，學(xué)者們就對(duì)腫瘤的免疫基因療法展開(kāi)了深入的研究。
2腫瘤免疫基因治療的概念
廣義的腫瘤基因治療概念認(rèn)為，凡是能夠改變腫瘤細(xì)胞或其他體細(xì)胞的遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能，而達(dá)到治療腫瘤目的的方法均屬于腫瘤基因治療的范疇。為區(qū)別傳統(tǒng)的化療及放療導(dǎo)致的遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能（核酸）變化，將腫瘤基因治療定義為：以適當(dāng)?shù)幕蜣D(zhuǎn)移技術(shù)將特定的外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞或患者體內(nèi)，通過(guò)外源遺傳物質(zhì)的表達(dá)產(chǎn)物或?qū)λ拗骷?xì)胞本身遺傳物質(zhì)表達(dá)的影響，直接或間接地殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞[3]。從基因操作角度看，基因治療主要有四種方法，及基因修正、基因置換、基因失活和基因修飾。近年來(lái)，免疫基因療法在腫瘤的治療中得到廣泛應(yīng)用。
腫瘤免疫基因治療是依賴于機(jī)體免疫功能的間接殺傷。腫瘤免疫基因治療的定義為：根據(jù)免疫學(xué)的理論論技術(shù)建立的、以基因轉(zhuǎn)移技術(shù)為基礎(chǔ)的、以激發(fā)機(jī)體腫瘤免疫效應(yīng)或提高免疫效應(yīng)細(xì)胞功能為目的的基因治療方法。免疫基因治療的發(fā)展反映了整個(gè)腫瘤基因治療歷史，首例得到美國(guó)FDA批準(zhǔn)的腫瘤基因治療的臨床計(jì)劃是由Rosenberg[4]提出，用細(xì)胞因子基因體外轉(zhuǎn)導(dǎo)修飾TIL，最后回輸患者體內(nèi)，治療晚期惡性腫瘤病人。
3免疫基因治療的方法
基因治療在口腔鱗癌中的治療前景包括用于治療口腔鱗癌的復(fù)發(fā)和輔助治療，例如作為外科手術(shù)后的輔助措施；發(fā)生局部遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的口腔癌患者也是基因治療的應(yīng)用方向之一。盡管全身用藥理論上可以到達(dá)轉(zhuǎn)移的病灶，但是基因治療不適宜于全身輸送。因?yàn)榇蠖鄶?shù)原發(fā)和復(fù)發(fā)病灶是很表淺的，因此口腔癌患者非常適宜局部直接注射治療。目前研究的用于治療口腔鱗癌的方法包括：1）添加抑癌基因-基因添加療法；2） 去除缺陷腫瘤基因-基因去除療法；3） 減少刺激腫瘤生長(zhǎng)的基因的表達(dá)-反義RNA；4） 增強(qiáng)免疫監(jiān)測(cè)-免疫療法；5） 前體藥物活化起到化療效應(yīng)-自殺基因療法；6） 病毒破壞腫瘤細(xì)胞的復(fù)制周期；7）呈送抗藥基因給正常組織以防止化療損傷。
4口腔癌癌基因的研究
迄今人們已在脊椎動(dòng)物細(xì)胞中確定了32種與逆轉(zhuǎn)錄病毒癌基因同源的細(xì)胞癌基因，其中20多種與腫瘤發(fā)生有關(guān)。研究口腔癌癌基因的表達(dá)以及癌基因產(chǎn)物的形成，對(duì)從分子水平認(rèn)識(shí)口腔癌的發(fā)病機(jī)制和生物學(xué)行為具有重要意義。Hoellering[5]等采用生物素化的H-ras，cDNA探針原位雜交技術(shù)和免疫組化技術(shù)，對(duì)5例口腔癌患者腫瘤組織中H-ras癌基因的mRNA及其產(chǎn)物P2蛋白進(jìn)行定位研究，發(fā)現(xiàn)H-ras癌基因與mRNA的分布可能與口腔癌的生長(zhǎng)方式及預(yù)后有關(guān)。且發(fā)現(xiàn)晚期口腔癌組織中均有ras和myc家族癌基因的擴(kuò)增。在口腔鱗癌中，c-myc表達(dá)量較正常組高2～5倍，平均水平為0.34±0.16pg /μg，其它與口腔腫瘤有關(guān)的癌基因還有c-erb-B2、fes、mos、myb等，其中ab1基因在口腔上皮癌細(xì)胞株的表達(dá)與其脫壁生長(zhǎng)特征有關(guān)。進(jìn)一步研究口腔腫瘤中癌基因的各種變化，無(wú)疑對(duì)揭示口腔腫瘤的發(fā)生機(jī)制和指導(dǎo)免疫基因治療具有重要意義。
5 口腔鱗癌的免疫基因療法
免疫基因療法治療口腔癌有兩種途徑：一是增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的致免性，一是提高患者對(duì)腫瘤的免疫反應(yīng)性。研究表明頭頸部鱗癌患者有數(shù)種免疫細(xì)胞功能缺陷，包括自然殺傷細(xì)胞、T細(xì)胞、以及一些細(xì)胞因子。盡管口腔癌沒(méi)有經(jīng)典的免疫性，但是很多證據(jù)表明其具有免疫識(shí)別功能。已進(jìn)行的動(dòng)物研究包括給予IL-2誘導(dǎo)產(chǎn)生LAK細(xì)胞、TNF- A，將 IL- 2、IL- 4、IFN- C、IL-6或IL-1B轉(zhuǎn)入腫瘤起到免疫調(diào)節(jié)作用聯(lián)合應(yīng)用非病毒脂質(zhì)體表達(dá)的鼠白介素 2和多聚體表達(dá)的mIL- 12治療口腔鱗癌，試驗(yàn)證明是可行并有效的[6]。mIL-2和mIL-12聯(lián)合運(yùn)用產(chǎn)生明顯的抗腫瘤效應(yīng)可能是由于其刺激增強(qiáng)了Tc細(xì)胞和NK的活性。此外，最新研究表明，應(yīng)用缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠?qū)NF-α基因?qū)肟谇击[癌DNL中，帶有TNF-α基因的DNL能夠分泌高活性的TNF-α，表明口腔鱗癌DNL可作為基因轉(zhuǎn)移的運(yùn)載細(xì)胞用于口腔鱗癌的細(xì)胞因子基因治療。
5.1 細(xì)胞因子與免疫基因治療
在當(dāng)前所開(kāi)展的基因治療研究中，免疫基因治療的研究多集中于細(xì)胞因子基因治療的研究。細(xì)胞因子的基因治療避免了以往細(xì)胞因子注射療法需反復(fù)多次給患者或動(dòng)物模型注射大劑量細(xì)胞因子所帶來(lái)的不良反應(yīng)，也取得了細(xì)胞因子注射療法所不具備的治療效果。細(xì)胞因子基因治療所選用的目的基因是可以編碼表達(dá)包括ILs、IFNs、CSFs及TNFs等在內(nèi)的各種細(xì)胞因子及其受體的基因[7]。依據(jù)將細(xì)胞因子基因?qū)塍w內(nèi)的途徑和原理不同，細(xì)胞因子基因治療可分為以下幾類：（1）以免疫效應(yīng)細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞因子基因治療；（2）以瘤苗為基礎(chǔ)的細(xì)胞因子基因治療；（3）以抗原呈遞細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞因子基因治療；（4）成纖維細(xì)胞等受體細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞因子基因治療；（5）直接體內(nèi)注射途徑的細(xì)胞因子基因治療。
5.2 抗體與免疫基因治療[8]
（1）抗體增強(qiáng)免疫基因治療的靶向性：解決免疫效應(yīng)細(xì)胞識(shí)別腫瘤細(xì)胞的特異性是腫瘤治療的關(guān)鍵之一，研究表明將腫瘤特異性單鏈抗體基因?qū)隩細(xì)胞中，使之分泌抗體，一方面通過(guò)抗體殺傷腫瘤細(xì)胞；另一方面通過(guò)抗體使特異性結(jié)合增加。
（2）抗體作為免疫基因治療的效應(yīng)分子：胞內(nèi)抗體可用于腫瘤治療。美國(guó)學(xué)者構(gòu)建了一種編碼單鏈抗體的載體（PGT21），將此載體轉(zhuǎn)入高表達(dá)erbB2的卵巢癌細(xì)胞株SKOV3細(xì)胞中，可以通過(guò)胞內(nèi)表達(dá)抗體erbB2單鏈抗體，抑制瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
（3）抗原與免疫基因治療：在腫瘤治療方面，經(jīng)FDA批準(zhǔn)，已有學(xué)者將編碼CEA、Ig基因表達(dá)載體直接導(dǎo)入結(jié)腸癌和口腔鱗癌患者體內(nèi)，臨床顯示其有一定抗腫瘤效應(yīng)。
5.3 綜合性免疫基因治療
有研究表明，單一途徑的免疫基因治療效果并不理想，因此，將相互間有相加或協(xié)同效應(yīng)的不同方法聯(lián)合起來(lái)治療口腔鱗癌的臨床效應(yīng)值得嘗試。目前主要的研究方向有：細(xì)胞因子基因治療與細(xì)胞因子基因治療的聯(lián)合；細(xì)胞因子基因治療與B7等共刺激分子基因治療聯(lián)合；細(xì)胞因子基因治療與MHC基因治療聯(lián)合；④細(xì)胞因子基因治療與抗原基因治療聯(lián)合；⑤細(xì)胞因子基因治療與自殺基因聯(lián)合治療。
6展望
綜上所述，口腔頜面鱗癌免疫基因療法發(fā)展至今，經(jīng)歷了從單一途徑療法轉(zhuǎn)向多途徑聯(lián)合治療的階段，進(jìn)一步提高了臨床療效。伴隨著新的免疫基因療法的不斷問(wèn)世，基因聯(lián)合療法的治療效果更加明顯，且不良反應(yīng)也大大降低。同時(shí)，結(jié)合口腔鱗癌術(shù)前術(shù)后輔助療法是可行的治療方式，并有望進(jìn)一步提高生存率。比較同期不同心的聯(lián)合基因療法的隨機(jī)試驗(yàn)仍在進(jìn)行中，這些試驗(yàn)將可能為治療口腔頜面部鱗癌患者治療中的作用確立1個(gè)新的位置。另外口腔鱗癌往往伴有第二原發(fā)腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，已經(jīng)成為影響患者長(zhǎng)期生存率的重要因素之一。免疫基因療法對(duì)于第二原發(fā)腫瘤的影響如何，有待進(jìn)一步研究。
免疫基因治療是一種新興的治療腫瘤的方法。隨著腫瘤分子生物化學(xué)研究的不斷深入，我們能夠拓展基因治療腫瘤的方法，選擇性針對(duì)腫瘤細(xì)胞。由于口腔鱗癌基因突變頻繁，位置表淺易于瘤內(nèi)給藥，因此基因治療適合運(yùn)用于口腔鱗癌?；虔煼ㄓ糜冖衿诘念^頸部鱗癌是安全有效的；對(duì)于Ⅱ期鱗癌，聯(lián)合放療或化療，也能起到抗瘤效應(yīng)；作為輔助措施治療Ⅲ期鱗癌的正在進(jìn)一步研究中。以后的研究方向在于建立起安全有效的利用免疫基因療法治療口腔鱗癌的方法體系。
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【中圖分類號(hào)】 R734.2【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 B【文章編號(hào)】 1007-8517(2009)24-0100-01
肺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,目前治療是以手術(shù)、化療、放療為主,聯(lián)合生物治療、中醫(yī)中藥治療等的綜合治療模式,但隨著腫瘤分子生物學(xué)、免疫學(xué)以及分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,肺癌生物治療不斷被賦予新的內(nèi)容,治療方法逐漸擴(kuò)展到基因治療、免疫治療以及近年來(lái)興起的分子靶向治療[1],為肺癌治療開(kāi)辟了更為廣闊的前景。本文就肺癌生物治療的現(xiàn)狀及研究進(jìn)展綜述如下。
1 肺癌生物治療現(xiàn)狀
生物治療的原理是通過(guò)為腫瘤患者補(bǔ)充具有殺死、抑制腫瘤能力的免疫細(xì)胞和能力,調(diào)節(jié)患者自身免疫功能,達(dá)到控制和清除腫瘤細(xì)胞的目的,主要包括細(xì)胞因子技術(shù)、基因治療技術(shù)、腫瘤疫苗技術(shù)、免疫活性細(xì)胞繼承性輸注技術(shù)、單克隆抗體及其耦聯(lián)物技術(shù)等[2],彼此之間并沒(méi)有明確的界限,它們的出現(xiàn)標(biāo)志著腫瘤生物治療體系的基本形成,雖然途徑與方法各異,但目的都是通過(guò)最大限度的利用人體自身所具有的抗腫瘤能力來(lái)治療惡性腫瘤。生物治療有自己獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn),毒副反應(yīng)較低.僅在高劑量時(shí)有低血壓、發(fā)熱皮疹、抗原抗體反應(yīng)等,發(fā)生率較低[3],臨床上治療肺癌應(yīng)用最多的為細(xì)胞因子,免疫調(diào)節(jié)劑、基因治療和分子靶向治療藥物也已應(yīng)用于臨床,過(guò)繼免疫細(xì)胞中淋巴活化殺傷細(xì)胞(LAK)已見(jiàn)報(bào)告,為今后生物治療的發(fā)展研究提供了豐富的內(nèi)容。
2 肺癌生物治療研究進(jìn)展
2.1 分子靶向治療腫瘤分子靶向治療是利用分子靶向藥物特異性,以腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞中所具有的特異性分子為靶點(diǎn),阻斷該靶點(diǎn)的生物學(xué)功能,或選擇性從分子水平來(lái)逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為,從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)甚至腫瘤消退的目的[4]。其中以表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)和腫瘤血管生成作為靶點(diǎn)的藥物占60%,以表皮生長(zhǎng)因子受體作為靶點(diǎn)的治療藥物包括吉非替尼、埃羅替尼、西妥昔單抗等,以腫瘤血管生成作為靶點(diǎn)的治療藥物包括貝伐單抗、ZD647、內(nèi)皮抑素、基質(zhì)金屬蛋白酶等,其它靶向治療藥物如基質(zhì)金屬蛋白激酶(MMPs)抑制劑、血管生成因子抑制劑、法尼基轉(zhuǎn)化酶抑制劑(FTIs)、環(huán)氧化酶抑制劑、組氨酸脫乙?；敢种苿┑确肿影邢蛐运幬镎谶M(jìn)行臨床前或臨床試驗(yàn)研究中[5]。
2.2 細(xì)胞因子治療 常用于肺癌的細(xì)胞因子有干擾素(IFN)、白細(xì)胞介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)、紅細(xì)胞生成素(EPO)和集落刺激因子(CSF)等。細(xì)胞因子的應(yīng)用是目前最成熟的生物治療方法,尤其是IFN和IL,目前已經(jīng)在肺癌治療中應(yīng)用非常成熟,CSF、TNF、EPO等也逐漸被廣泛應(yīng)用,在腫瘤的治療中起到了重要作用。IFN是最早發(fā)現(xiàn)具有抗癌效應(yīng)的細(xì)胞因子,早在1980年第一次用于小細(xì)胞肺癌(SCLC)的實(shí)驗(yàn)中就顯示出了良好的前景。IL一24是近來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新白介素,利用腺病毒轉(zhuǎn)染的方法發(fā)現(xiàn)其可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖并可以增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。CSF及EPO的應(yīng)用對(duì)于克服骨髓抑制、預(yù)防傳統(tǒng)放化療所產(chǎn)生的白細(xì)胞下降及紅細(xì)胞減少無(wú)疑起到了保駕護(hù)航的作用,為提高放化療藥物的使用劑量從而達(dá)到更好的治療效果起到了關(guān)鍵作用[6]。
2.3 免疫治療 主要包括腫瘤疫苗、過(guò)繼性免疫治療及補(bǔ)充細(xì)胞因子,其中發(fā)展最快的是腫瘤疫苗。目前應(yīng)用的肺癌疫苗有腫瘤細(xì)胞疫苗、胚胎抗原疫苗、病毒疫苗、癌基因產(chǎn)物疫苗、人工合成多肽疫苗、抗獨(dú)特型疫苗和樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗等,樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗能形成強(qiáng)有力的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答,有效地清除血源性播散的肺癌細(xì)胞,發(fā)展最為矚目[7],Ueda等應(yīng)用CEA652體外沖擊致敏樹(shù)突細(xì)胞,治療CEA陽(yáng)性的肺腺癌患者,發(fā)現(xiàn)治療后患者病情穩(wěn)定,血清中CEA水平明顯降低。受到重視的還有第3代疫苗:核酸疫苗,包括DNA疫苗和RNA疫苗, DNA疫苗在體內(nèi)可持續(xù)高表達(dá)相應(yīng)抗原,被樹(shù)突細(xì)胞攝取并致敏后,激發(fā)高效的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng),是最有潛力的腫瘤疫苗發(fā)展方向。
2.4 基因治療
2.4.1p53基因治療 在基因治療研究中,以腺病毒轉(zhuǎn)染抑癌基因p53的表達(dá)研究較為成功。國(guó)外對(duì)重組腺病毒介導(dǎo)的p53基因治療NSCLC的臨床研究已基本完成,結(jié)果顯示腺病毒p53注射液在NSCLC中有抗瘤活性。一項(xiàng)研究中,對(duì)12例氣道阻塞且無(wú)法手術(shù)的肺癌患者瘤內(nèi)注射重組腺病毒p53注射液106―1011pfu,28天重復(fù)一次,其中6例患者癥狀得到緩解。然而也有研究者將重組腺病毒p53注射液聯(lián)合化療治療NSClC,發(fā)現(xiàn)兩組療效和生存期無(wú)顯著差異。
2.4.2 殺傷基因?qū)⒕哂袣饔玫幕蚱螌?dǎo)入細(xì)胞復(fù)制的DNA序列中,從而打斷細(xì)胞基因的連續(xù)性,抑制基因的過(guò)量表達(dá)和腫瘤細(xì)胞的增殖。自殺基因和凋亡基因通過(guò)引發(fā)腫瘤細(xì)胞的凋亡而起到殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。TK基因-GCV系統(tǒng)是最有希望在臨床上用于腫瘤基因治療的方法之一,在肺癌基因治療中具有顯著作用。
2.4.3 RNAi技術(shù) 在針對(duì)腫瘤的基因治療策略中,RNAi技術(shù)以其自身的諸多優(yōu)勢(shì),在不影響正?；蚬δ艿那疤嵯?可以針對(duì)在細(xì)胞癌變過(guò)程中發(fā)揮重要作用的原癌基因、抑癌基因、凋亡相關(guān)基因、血管生成因子及其受體以及部分關(guān)鍵酶等,抑制突變基因表達(dá)或基因的過(guò)量表達(dá)。如Zhang等用HER-1 siRNA抑制了肺癌細(xì)胞A549的EGFR的表達(dá),使肺癌細(xì)胞比對(duì)照組細(xì)胞數(shù)減少了85%,EGFR蛋白表達(dá)下降了70%以上,對(duì)順鉑的敏感性增加了4倍。
3 展望
作為一種新的治療模式,生物治療目前還存在很多問(wèn)題,如各種治療藥物的有效性、安全性還有待于進(jìn)一步評(píng)價(jià),是否有必要采用特異性檢測(cè)手段篩選分子靶向藥物的適應(yīng)人群來(lái)實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥,及建立這類藥物與手術(shù)、放化療之間的最佳聯(lián)合方案還需不斷摸索。但我們深信在不久的將來(lái),隨著對(duì)腫瘤生物學(xué)特性和行為了解的不斷加深、分子藥物研究的不斷發(fā)展,將會(huì)出現(xiàn)一批新型的低毒、高效靶向治療藥物,為肺癌乃至其他所有腫瘤患者帶來(lái)福音。
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【關(guān)鍵詞】 六味地黃丸/藥理學(xué) 肝腫瘤/中西醫(yī)結(jié)合療法 腫瘤/病理學(xué) 細(xì)胞凋亡 基因療法 自殺基因
疾病模型，動(dòng)物； 小鼠
肝癌的基因治療，特別是自殺基因治療，在控制腫瘤的增殖、預(yù)防和延緩復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，以及提高病人生活質(zhì)量方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，成為肝癌治療活躍的研究領(lǐng)域［1-3］。從已有的研究結(jié)果來(lái)看，單純自殺基因治療仍難以達(dá)到完全根治腫瘤的目的。因此，尋找自殺基因療法的增效方法是目前各種腫瘤自殺基因治療的研究熱點(diǎn)之一。
免疫機(jī)制是旁觀者效應(yīng)產(chǎn)生的重要機(jī)制［4-5］，改善自殺基因療法作用的炎癥免疫微環(huán)境是自殺基因療法增效的主要途徑［6-7］。六味地黃丸具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和直接抗腫瘤作用［8-13］，我們前期的研究結(jié)果顯示其對(duì)小鼠移植性肝癌HSVtk/GCV自殺基因治療具有增效作用［14］，本文旨在觀察其療效的病理學(xué)機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。
1 材料和方法
1.1 主要試劑與儀器 細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、濾膜、凍存管等為美國(guó)Corning公司和丹麥NUNC公司產(chǎn)品；Polybrene和G418為Sigma公司產(chǎn)品；DMEM、RPMI1640、胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品；新生牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品。主要儀器為BNA3210型CO2培養(yǎng)箱（日本ESPEC），億鳴200病理圖像分析系統(tǒng)（中國(guó)億鳴）等。
1.2 動(dòng)物 昆明種小鼠，18～22g，雄性占2/3，雌性占1/3，健康，清潔級(jí)，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（合格證號(hào)：2003A008）。
1.3 細(xì)胞株 病毒包裝細(xì)胞PT67購(gòu)自美國(guó)Clontech公司，已于前期將重組pLXSNtk質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入PT67細(xì)胞內(nèi)記為PT67/tk［15］；小鼠肝細(xì)胞癌細(xì)胞株H22購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心細(xì)胞庫(kù)。
1.4 藥物及配制 六味地黃丸為北京同仁堂產(chǎn)品（批號(hào)：4030098），于無(wú)菌室內(nèi)用消毒研缽加少許消毒蒸餾水研磨后，配成濃度為500g/L的藥液，小鼠給藥劑量為生藥10g·kg-1·d-1；丙氧鳥(niǎo)苷（GCV）為麗珠集團(tuán)湖北科益藥業(yè)有限公司產(chǎn)品（批號(hào)：040701），于無(wú)菌室以注射用生理鹽水25mL溶解，濃度為10g/L，小鼠給藥劑量為100mg·kg-1·d-1。
1.5 小鼠肝細(xì)胞癌細(xì)胞株H22的感染及GCV體外殺傷效應(yīng)的觀察 復(fù)蘇包裝細(xì)胞PT67/tk，吸取其培養(yǎng)上清液，加入H22的培養(yǎng)液中，上清液病毒感染H22細(xì)胞后用G418(800mg/L)篩選，獲得抗性細(xì)胞克隆，命名為H22/tk，將H22/tk和野生型H22細(xì)胞分別以2×103、3×103、5×103個(gè)/孔接種96孔板，同時(shí)加入不同濃度的GCV使終濃度分別為0.01、0.1、1、10、100mg/L，以不加GCV的細(xì)胞孔作對(duì)照，每一個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，于倒置顯微鏡下觀察殺傷效應(yīng)。
1.6 造模及治療
1.6.1 小鼠移植性肝癌的造模 將H22/tk和野生型H22按1：4混合（模擬臨床體內(nèi)病毒感染腫瘤細(xì)胞比率10%～20%）。混合后的細(xì)胞制備成1×1010個(gè)/L的細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)活細(xì)胞計(jì)數(shù)＞90%；按0.2mL/只（含2×106個(gè)腫瘤細(xì)胞）細(xì)胞懸液接種于小鼠的皮下。
1.6.2 分組及治療 昆明種小鼠90只，隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、六味地黃丸治療組、自殺基因治療組、聯(lián)合治療組（自殺基因聯(lián)合六味地黃丸），正常對(duì)照組10只，其他組各20只。正常對(duì)照組右前肢腋下注射生理鹽水0.2mL，其他各組右前肢腋下接種肝癌細(xì)胞懸液0.2mL。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組第2～16天蒸餾水灌胃每天0.5mL/只，第6～16天腹腔注射生理鹽水每天0.25mL/只；六味地黃丸治療組第2～16天六味地黃丸懸液灌胃每天0.5mL/只，第6～16天腹腔注射生理鹽水每天0.25mL/只；自殺基因治療組第2～16天蒸餾水灌胃每天0.5mL/只，第6～16天腹腔注射GCV每天0.25mL/只；聯(lián)合治療組第2～16天六味地黃丸懸液灌胃每天0.5mL/只，第6～16天腹腔注射GCV每天0.25mL/只。
1.7 療效觀察及病理學(xué)機(jī)制
1.7.1 腫瘤質(zhì)量及抑瘤率 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死動(dòng)物，用眼科剪分離剝?nèi)∧[瘤，萬(wàn)分之一電子天平稱質(zhì)量，記錄結(jié)果。計(jì)算抑瘤率［16］:p抑瘤/%=（mmodel－mtreatment）/mmodel×100%。
1.7.2 病理學(xué)觀察及半定量分析 腫瘤用體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡觀察腫瘤細(xì)胞的密度、腫瘤壞死、間質(zhì)反應(yīng)，并采用盲法評(píng)分。腫瘤細(xì)胞密度：根據(jù)腫瘤細(xì)胞大小及密集程度分為+、++、+++3個(gè)等級(jí)。壞死分為+：灶狀壞死；++：網(wǎng)狀多灶狀壞死；+++：大片狀壞死。纖維結(jié)締組織根據(jù)腫瘤間質(zhì)內(nèi)及瘤周纖維的增生情況由低到高依次分為+、++、+++3個(gè)等級(jí)。腫瘤細(xì)胞核分裂像計(jì)數(shù)方法為每張HE染色切片隨機(jī)取5個(gè)非壞死區(qū)域高倍視野，對(duì)核分裂像進(jìn)行計(jì)數(shù)。
1.7.3 增殖核抗原（PCNA）免疫組化染色及陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù) 采用免疫組化SP法。切片脫蠟至水，入體積分?jǐn)?shù)1%過(guò)氧化氫溶液20min；磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗，5min×3次；滴加封閉液，20min；滴加增殖核抗原抗體，37℃濕盒，60min；PBS漂洗，5min×3次；滴加生物素標(biāo)記二抗，30min；PBS漂洗，5min×3次；滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素，60min；PBS漂洗，5min×4次；聯(lián)苯二胺(DAB)顯色，10min，Mayer蘇木素復(fù)染5s，干燥后中性樹(shù)膠封片。胞核呈棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞，每張切片隨機(jī)取5個(gè)非壞死區(qū)域高倍視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)并取平均值。
1.7.4 腫瘤細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 采用原位末端標(biāo)記（TUNEL）法。切片脫蠟至水；蛋白酶K消化10min；PBS漂洗，5min×3次；滴加反應(yīng)液，37℃濕盒，60min；PBS漂洗，5min×3次；加入體積分?jǐn)?shù)0.3%的過(guò)氧化氫，20min；PBS漂洗，5min×3次；滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，30min；PBS漂洗，5min×3次；DAB染色10min，Mayer蘇木素復(fù)染，干燥后中性樹(shù)膠封片。以胸腺組織為陽(yáng)性對(duì)照，不加末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶作為陰性對(duì)照。細(xì)胞核呈棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞，每片隨機(jī)選取5個(gè)非壞死區(qū)域高倍視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞的個(gè)數(shù)，以同一視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比表示細(xì)胞凋亡指數(shù)：p凋亡/%=(n陽(yáng)性細(xì)胞/n總細(xì)胞）×100%。
1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析；等級(jí)資料采用Ridit分析。
2 結(jié)果
2.1 體外殺傷效應(yīng) 鋪板48h后，H22/tk100mg/L濃度孔中細(xì)胞開(kāi)始死亡，表現(xiàn)為胞膜不完整，輪廓模糊，不透亮，形狀不規(guī)則，并且碎裂成小粒狀；10mg/L以下組僅見(jiàn)極少數(shù)細(xì)胞死亡，且增殖明顯。野生型H22細(xì)胞均呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞增殖。72h后，H22/tk的GCV100mg/L以上濃度孔中絕大部分細(xì)胞碎裂成小粒狀，孔內(nèi)基本無(wú)活細(xì)胞生存；其他包括野生型H22細(xì)胞孔均呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞增殖。表明體外病毒感染肝癌細(xì)胞成功，病毒攜帶的外源性自殺基因已表達(dá)且具有生物學(xué)活性，可用于體內(nèi)治療的實(shí)驗(yàn)研究。
2.2 腫瘤質(zhì)量及抑瘤率 表1結(jié)果表明，各治療組腫瘤質(zhì)量均較模型對(duì)照組輕，其中聯(lián)合治療組與模型對(duì)照組比較，差異有顯著性意義（P＜0.05）。
2.3 病理學(xué)觀察及半定量分析 各組腫瘤細(xì)胞均表現(xiàn)為大小不一，核大深染，形狀不規(guī)則，腫瘤間質(zhì)內(nèi)及瘤周有不同程度的纖維結(jié)締組織增生，腫瘤組織內(nèi)均可見(jiàn)不同程度的大片壞死。模型對(duì)照組與六味地黃丸治療組均見(jiàn)腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞密度較大，自殺基因治療組與聯(lián)合治療組見(jiàn)腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞密度較低，僅自殺基因治療組腫瘤細(xì)胞密度與模型對(duì)照組比較差異有顯著性意義（P＜0.05），見(jiàn)表2，圖1。
2.4 腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡 六味地黃丸治療組和聯(lián)合治療組核分裂像明顯少于腫瘤模型組和自殺基因治療組，其中聯(lián)合治療組核分裂像最少。增殖核抗原陽(yáng)性細(xì)胞著色部位位于細(xì)胞核，呈黃褐色，六味地黃丸治療組與聯(lián)合治療組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均少于其他兩組，以聯(lián)合治療組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最少。各治療組腫瘤細(xì)胞凋亡較模型對(duì)照組明顯增多，以聯(lián)合治療組最明顯，見(jiàn)表3，圖2-4。表1 各組小鼠腫瘤質(zhì)量及抑瘤率比較表2 各組病理分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果表3 各組腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡檢測(cè)結(jié)果
3 討論
自殺基因是指在一定條件下，可以引起細(xì)胞自動(dòng)死亡的基因。目前常用的自殺基因是通過(guò)編碼病毒或細(xì)菌的酶介導(dǎo)敏感性，而這些酶能把藥物的無(wú)活性形式轉(zhuǎn)化為毒性代謝產(chǎn)物，從而抑制核酸合成，導(dǎo)致細(xì)胞死亡［16］。
HSVtk/GCV為目前研究最深入、最具有應(yīng)用前景的腫瘤自殺基因治療系統(tǒng)之一，已廣泛應(yīng)用于各種惡性腫瘤的治療，并已進(jìn)入Ⅲ期臨床實(shí)驗(yàn)。HSVtk基因在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)胸苷激酶，可催化核苷類似物，如丙氧鳥(niǎo)苷（GCV）等形成單磷酸化產(chǎn)物，并在細(xì)胞內(nèi)磷酸激酶作用下形成三磷酸產(chǎn)物，干擾細(xì)胞分裂時(shí)DNA合成，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡［17］。
自殺基因治療由于存在旁觀者效應(yīng)（bystander effect）的獨(dú)特機(jī)制已成為惡性腫瘤基因治療的研究熱點(diǎn)和最具有應(yīng)用前景的腫瘤基因治療方法。所謂旁觀者效應(yīng)是指導(dǎo)入了自殺基因的腫瘤細(xì)胞加入前體藥物后，不僅自身被殺死，其鄰近未導(dǎo)入自殺基因的細(xì)胞也被殺死的現(xiàn)象［18］。由于存在旁觀者效應(yīng)，自殺基因療法對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用被有效地放大。旁觀者效應(yīng)形成機(jī)制的假說(shuō)主要包括［18］：(1)"縫隙連接"機(jī)制；(2)免疫介導(dǎo)機(jī)制；(3)"細(xì)胞凋亡"機(jī)制；（4）介質(zhì)機(jī)制；(5)抗腫瘤血管生成機(jī)制，等等。
由于免疫介導(dǎo)機(jī)制在體內(nèi)自殺基因療法旁觀者效應(yīng)中的重要作用。改善自殺基因抗腫瘤作用的炎癥免疫微環(huán)境是提高自殺基因療法療效的重要策略?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明，滋陰補(bǔ)腎代表復(fù)方六味地黃丸（湯）對(duì)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫均有明顯的增強(qiáng)效應(yīng)；能明顯改善荷瘤機(jī)體的免疫狀態(tài)，并具有一定的直接抗腫瘤作用。我們以六味地黃丸的免疫藥理作用與腫瘤自殺基因療法旁觀者效應(yīng)的免疫介導(dǎo)機(jī)制之內(nèi)在聯(lián)系為研究的切入點(diǎn)，以實(shí)驗(yàn)性肝細(xì)胞癌為治療對(duì)象，比較研究了自殺基因療法聯(lián)合六味地黃丸治療與單純自殺基因治療或單純六味地黃丸治療的抗腫瘤效果。研究結(jié)果顯示：聯(lián)合治療組對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用較單純自殺基因治療組或單純六味地黃丸治療組更為明顯［14］。
在進(jìn)一步的病理學(xué)研究中，雖然病理學(xué)觀察表明自殺基因治療組與聯(lián)合治療組的腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞密度較低，各治療組纖維組織增生均較明顯，但通過(guò)盲法對(duì)腫瘤的病理定量分析研究則顯示腫瘤細(xì)胞密度、腫瘤壞死、間質(zhì)反應(yīng)各組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造成這種現(xiàn)象的原因最有可能是觀察者不能很好地把握分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，以及病理半定量分析的不夠精確，這有待于通過(guò)多次的重復(fù)實(shí)驗(yàn)及增加樣本量或運(yùn)用更為精確的分析方法（如圖像分析等）來(lái)解決。 腫瘤的生長(zhǎng)速度與腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡速度相關(guān)。PCNA與細(xì)胞核分裂像均為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖能力的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：聯(lián)合治療組與六味地黃丸治療組的PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及核分裂像數(shù)均少于模型組、自殺基因治療組，其中聯(lián)合治療組與模型組、自殺基因治療組比較，差異均有顯著性意義(P＜0.05)，結(jié)果說(shuō)明六味地黃丸可能具有一定的抑制腫瘤增殖的作用；其他各組間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而自殺基因治療組從絕對(duì)值看略高于模型對(duì)照組，其結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)自殺基因治療后殘存腫瘤細(xì)胞會(huì)加速增殖相符。同時(shí)，從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，各治療組腫瘤細(xì)胞凋亡均有增多，聯(lián)合治療也顯示了更明顯的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效果。
本研究結(jié)果提示：腫瘤細(xì)胞增殖抑制和腫瘤細(xì)胞凋亡增多都與六味地黃丸對(duì)肝癌自殺基因治療的增效作用有關(guān)。其機(jī)理可能是在六味地黃丸的參與下，不僅發(fā)揮了直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的功效，而且通過(guò)對(duì)機(jī)體整體與局部的抗腫瘤免疫的調(diào)節(jié)或其他機(jī)制（如"縫隙連接"機(jī)制等），使得自殺基因治療的旁觀者效應(yīng)在力度上得以增強(qiáng)，在時(shí)限上得以延續(xù)，從而更好地發(fā)揮了自殺基因療法的抗腫瘤作用。
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【關(guān)鍵詞】超聲微泡；雙自殺基因慢病毒載體；基因治療
【中圖分類號(hào)】R341 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1004-7484（2012）13-0013-02
目前，基因治療已成為一種全新的腫瘤治療模式，其中自殺基因治療是一種頗具臨床應(yīng)用潛力的治療策略， 但是由于治療的靶向性成為關(guān)系到治療安全性的瓶頸問(wèn)題。近年來(lái)研究表明[1-5]，超聲微泡造影劑有望成為一種新型的體內(nèi)靶向給藥的載體系統(tǒng)。本研究旨在構(gòu)建超聲微泡包裹的特異性雙自殺基因慢病毒載體，為臨床實(shí)時(shí)可視狀態(tài)進(jìn)行超聲定位控釋和載質(zhì)粒微泡基因治療奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 雙自殺基因慢病毒載體pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的構(gòu)建與包裝
1.1.1目的基因的擴(kuò)增與TA克隆
提取正常人外周血gDNA，并通過(guò)PCR方法擴(kuò)增出KDRP、CD、TK基因；回收
PCR產(chǎn)物并分別將其鏈接到pMD18-T載體上，構(gòu)成重組T質(zhì)粒；抽提質(zhì)粒，并對(duì)各重組T質(zhì)粒的酶切鑒定及測(cè)序；
1.1.2 慢病毒載體構(gòu)建與包裝鑒定
將經(jīng)測(cè)序證實(shí)的T-KDRP、T-CD、T-TK三種質(zhì)粒上的KDRP、CD、TK元件通過(guò)特定的限制性內(nèi)切酶酶切后，依次連接到經(jīng)相應(yīng)酶酶切的pLenti6-EGFP載體上，經(jīng)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，24h后通過(guò)熒光顯微鏡即可見(jiàn)GFP熒光表達(dá)，72h后收集上清，0.45um濾器過(guò)濾，25000rpm離心90min，沉淀溶于Hanks溶液，-80℃貯存?zhèn)溆?。將梯度稀釋的病毒液，加?93T細(xì)胞中，72h后置于熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況，計(jì)數(shù)發(fā)熒光細(xì)胞數(shù)目，根據(jù)病毒用量和稀釋度計(jì)算滴度。按公式計(jì)算病毒滴度：
病毒滴度=GFP細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)×病毒上清稀釋倍數(shù)/0. 4m1（pfu/ml）。
1.2 載藥粒微泡的制備于鑒定
1.2.1載藥粒微泡的制備
聲諾維sonovue為磷脂包裹的六氟化硫（SF6），按使用說(shuō)明注入生理鹽水5 ml震蕩形成微泡混懸液。取50ul微泡懸液于1.5mlEP管內(nèi)，再滴加入100MOI病毒載量的病毒上清液，輕輕混勻后室溫孵育20 min。
1.2.2載藥粒微泡的鑒定方法。
采用Malvern激光測(cè)量?jī)x檢測(cè)載藥微泡的粒徑大小，光學(xué)顯微鏡觀察其外觀，采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測(cè)定載藥微泡的包封率和載藥量。
（1）粒徑大小比較
載質(zhì)粒微泡為白色混懸液，PBS（Phosphate buffered saline 磷酸鹽緩沖生理鹽水）沖洗，靜置后分三層，上層、中間層為微泡，下層為PBS液。去除上層及下層液，取中層液，測(cè)定其粒徑大小，鏡下比較觀察載藥微泡與空白微泡外觀。
（2）包封率的測(cè)定
將制備好的含有慢病毒載體的微泡溶液中加入5%乙醇1 mL混勻，6℃，16000 rpm高速離心20min，去上層微泡，取下層液體，加5%乙醇0.5 mL稀釋沖洗，再加入適量乙醚，漩渦振搖，6000 rpm離心15 min，取乙醚層，50℃水浴揮干后，加0.5 mL甲醇溶解作為樣液，進(jìn)樣量10μL。采用RP-HPLC測(cè)定雙自殺基因慢病毒載體pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的包封率，按下式計(jì)算包封率：
包封率（%）=[（投入藥量―游離藥量）/投入藥量]×100%
（3）載藥量的測(cè)定
以下式計(jì)算載藥量：
載藥量%=（Wt～Wi）/Wc×100%
其中Wt為脂質(zhì)微泡溶液中藥物總含量，Wi為游離藥物量，Wc為磷脂用量。
（4）穩(wěn)定性測(cè)定
4℃冰箱貯存，對(duì)短期內(nèi)的載藥微泡溶液的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
取少量載藥微泡混懸液分別于1d、2d、5d、8d、10 d經(jīng)光學(xué)顯微鏡（×400）進(jìn)行觀察其形態(tài)變化。第10 d的取該樣品由Malvern粒徑測(cè)量?jī)x檢測(cè)粒徑。4℃冰箱貯存10 d后，RP-HPLC測(cè)定載藥微泡溶液的包封率。
2 結(jié)果
2.1 病毒滴度檢測(cè)結(jié)果：
經(jīng)熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況，計(jì)數(shù)發(fā)熒光細(xì)胞數(shù)目，根據(jù)病毒用量和稀釋度，獲得病毒滴度為（3.5×1012pfu/L）的雙自殺基因慢病毒載體pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK。
2.2 載藥微泡質(zhì)量鑒定：
2.2.1包裹有pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的聲諾維微泡與空白聲諾維微泡粒徑的對(duì)比觀察：
載質(zhì)粒微泡呈乳白色混懸液，用磷酸鹽緩沖生理鹽水（Phosphate buffered saline PBS）沖洗，靜置后分三層，上層、中間層為微泡，下層為PBS液。
鏡下比較觀察載質(zhì)粒微泡（圖A）與空白微泡（圖B）的形態(tài)，其形態(tài)相近，為近似的圓形微泡。其粒徑范圍92%在2～5μm之間，平均粒徑約2.90μm（圖A），粒徑大小均相似。
2.2.2 包封率和載藥量測(cè)定結(jié)果
采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測(cè)定載藥微泡的包封率和載藥量，
得到結(jié)果：
包封率為90.6±3.1%。載藥量為29.2±0.9%。
2.2.3 穩(wěn)定性測(cè)定：
4℃冰箱貯存10 d后，可見(jiàn)仍為乳白色混懸液，光鏡下觀察，微泡粒徑大小未見(jiàn)明顯變化，微泡形態(tài)好，大小均勻，相互之間無(wú)明顯聚集現(xiàn)象，分層情況基本同前，樣品經(jīng)光鏡下觀察及Malvern測(cè)量?jī)x檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與制備初始相比，平均粒徑大小約3.08μm），未見(jiàn)明顯變化；RP-HPLC測(cè)得包封率：86.1±2.8%，沒(méi)有出現(xiàn)明顯藥物滲漏。
3 討論
基因治療已成為一種全新的腫瘤治療模式，其中自殺基因治療是近年來(lái)新興的腫瘤基因治療的研究熱點(diǎn)。自殺基因療法是利用基因工程技術(shù)將自殺基因轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，注入體內(nèi)的無(wú)毒或低毒的前藥在表達(dá)的特異性酶作用下轉(zhuǎn)化成毒性產(chǎn)物，該產(chǎn)物可作為DNA合成的核苷替代物摻入到DNA中，干擾細(xì)胞DNA的合成，從而引起腫瘤細(xì)胞的死亡[6]。
本研究所采用的克隆方法并不是將PCR產(chǎn)物直接與表達(dá)載體相連接，而是先將PCR產(chǎn)物TA克隆，構(gòu)建成重組T質(zhì)粒后再將目的基因與表達(dá)載體酶切連接，主要是考慮到：PCR產(chǎn)物直接進(jìn)表達(dá)載體成功率不高；而先進(jìn)T載體，再酶切連接表達(dá)載體，可減少堿基錯(cuò)配，提高成功率。目前己發(fā)現(xiàn)的自殺基因體系已有十多種，本實(shí)驗(yàn)選擇胞嚓陡脫氨基酶基因（CD）和單純疤疹病毒胸普激酶基因 （HsV-TK簡(jiǎn)稱TK）來(lái)構(gòu)建雙自殺基因質(zhì)粒，是因?yàn)檠芯勘砻鱗7]，二者作用機(jī)制具有很強(qiáng)的互補(bǔ)性，將其連接在一起，構(gòu)成融合基因，使兩個(gè)自殺基因體系協(xié)同作用，能顯著增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。同時(shí)選用腫瘤特異性啟動(dòng)子KDRP，突破對(duì)腫瘤細(xì)胞類型的依賴性，擴(kuò)大腫瘤基因治療譜。運(yùn)用增強(qiáng)型GFP綠色熒光蛋白作為報(bào)告基因，可直觀的檢測(cè)目的基因的檢測(cè)和計(jì)算病毒滴度。而慢病毒載體最大的特點(diǎn)是可以感染分裂期及非分裂期細(xì)胞，容納外源性目的基因的片段大，可以在體內(nèi)長(zhǎng)期地表達(dá)，不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)，安全性較好，可在更多范圍的宿主細(xì)胞內(nèi)生成高滴度的病毒，己成為當(dāng)前基因治療中載體研究的熱點(diǎn)。
超聲微泡造影劑聲諾維可作為一種新型基因載體。在一定劑量超聲波的輻照下，利用微泡在超聲介導(dǎo)下的空化效應(yīng)介導(dǎo)目的基因的靶向釋放和導(dǎo)入。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)空化效應(yīng)是超聲介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的主要機(jī)制，微泡造影劑作為外源性空化核被引入體內(nèi)后大大增加了單位體積內(nèi)空化核的數(shù)量，降低超聲波的空化閉值，增強(qiáng)空化效應(yīng)，從而提高基因轉(zhuǎn)染效率[3-4]，尤其在抗腫瘤治療、溶栓治療等方面具有潛在的重要應(yīng)用價(jià)值。經(jīng)靜脈注入載藥微泡后，用超聲輻照特定部位，含氣體的超聲造影劑在超聲波作用下會(huì)不斷地產(chǎn)生非對(duì)稱性收縮和膨脹，當(dāng)聲能達(dá)到一定強(qiáng)度時(shí)，微泡破裂藥物被釋放到超聲所輻照的局部組織中。在這一過(guò)程中，微泡作為空化核增強(qiáng)空化效應(yīng)，依靠能量輻射作用，使微泡破壞后釋放的藥物能夠進(jìn)入血管壁甚至組織間隙，從而發(fā)揮定位靶向治療作用[2]。
而載藥微泡的外觀、粒徑大小、包封率、載藥量等是衡量載藥脂質(zhì)微泡質(zhì)量的最重要指標(biāo)。我們制作的載雙自殺基因慢病毒載體微泡乳化良好，大小均勻，粒徑范圍92%在2-5μm，與空白微泡相似。微泡內(nèi)藥物的包封率為90.6±3.1%，載藥量為29.2±0.9%，均達(dá)到較理想的水平。此外穩(wěn)定性也是衡量載藥脂質(zhì)微泡特性的主要指標(biāo)之一，它能反映脂質(zhì)微泡溶液包封率隨時(shí)間變化的情況。脂質(zhì)微泡作為藥物載體穩(wěn)定性是指被包裹藥物在脂質(zhì)微泡中的滯留性。經(jīng)由本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，我們制作的載藥微泡同時(shí)也具有較高的穩(wěn)定性。
本研究聯(lián)合了雙自殺基因的殺傷效應(yīng)、KDR啟動(dòng)子的腫瘤特異性、慢病毒載體的高載性和超聲微泡靶向的可控釋性等多種技術(shù)優(yōu)點(diǎn)，制備出了較為理想的載有靶向基因藥物的微泡，期望為進(jìn)一步臨床實(shí)施可視狀態(tài)下的腫瘤的基因治療提供一種更加安全、高效的策略。
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作者簡(jiǎn)介：
郝軼，碩士，主治醫(yī)師，新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，830011。
基金項(xiàng)目：
新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金（編號(hào)：2011211B19）Correspondence to：HAO Yi（郝軼）
