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關(guān)鍵詞：事實勞動關(guān)系；法律風(fēng)險；防范措施
一、事實勞動關(guān)系的內(nèi)涵及產(chǎn)生原因
（一）事實勞動關(guān)系的內(nèi)涵。所謂勞動關(guān)系，是指勞動者與勞動力使用者（用人單位）之間在勞動生產(chǎn)過程中建立或結(jié)成的關(guān)系。勞動關(guān)系具有以下特征：當(dāng)事人一方是勞動者，另一方必須是提供生產(chǎn)資料的用人單位；勞動者必須是基于職業(yè)的、為實現(xiàn)用人單位的勞動過程而進(jìn)行有償?shù)膭趧?；勞動者必須成為用人單位的成員，并遵守單位的內(nèi)部勞動規(guī)則，主體雙方具有平等性和隸屬性。
事實勞動關(guān)系是用人單位與勞動者之間既無勞動合同又存在著勞動關(guān)系的一種狀態(tài)。事實勞動關(guān)系區(qū)別于勞動關(guān)系只因其缺乏法律所規(guī)定的形式要件―書面勞動合同，但其本質(zhì)上屬于勞動關(guān)系。是否成立事實勞動關(guān)系可依據(jù)其是否具有勞動關(guān)系的特征來判斷。
（二）事實勞動關(guān)系產(chǎn)生的原因。實踐中，事實勞動關(guān)系大量存在，但究其產(chǎn)生的原因主要集中在以下兩點(diǎn)：其一，自勞動關(guān)系建立之時起，從未訂立書面勞動合同。依據(jù)《中華人民共和國勞動合同法》（以下簡稱《勞動合同法》）第十條： “建立勞動關(guān)系，應(yīng)當(dāng)訂立書面勞動合同。已建立勞動關(guān)系，未同時訂立書面勞動合同的，應(yīng)當(dāng)自用工之日起一個月內(nèi)訂立書面勞動合同。用人單位與勞動者在用工前訂立勞動合同的，勞動關(guān)系自用工之日起建立?！笨梢?，引起勞動關(guān)系產(chǎn)生的基本法律事實是用工，而不是訂立勞動合同，其目的保護(hù)事實勞動關(guān)系中勞動者的權(quán)益，而非肯定用人單位不與勞動者訂立勞動合同的行為。在就業(yè)競爭激烈，勞動力供大于求的情況下，不簽勞動合同用人單位便擁有更多的靈活性，是否簽訂勞動合同的主動權(quán)往往掌握在用人單位手中。我國勞動法對勞動者的傾斜保護(hù)的立法宗旨，要求建立勞動關(guān)系應(yīng)當(dāng)訂立書面勞動合同的規(guī)定，使一些人錯誤地認(rèn)為：訂立了勞動合同勞動者就受勞動法的保護(hù)，未訂立勞動合同的勞動法不給予保護(hù)。用人單位為逃避相關(guān)法律法規(guī)的強(qiáng)制性義務(wù)如繳納社會保險等不與勞動者簽書面勞動合同?，F(xiàn)實中，不簽訂勞動合同也可能是勞動者認(rèn)為有了書面勞動合同會約束自己不能隨意“跳槽”，主動要求不簽或者故意拖延不簽而用人單位沒有及時作出處理。再或者是雙方法律意識淡薄，根本沒有意識到建立勞動關(guān)系必須簽訂書面勞動合同，達(dá)成了不簽勞動合同的合意。其二，原勞動合同期滿后，當(dāng)事人未續(xù)訂新的勞動合同，但勞動者仍在該單位繼續(xù)勞動。人力資源管理實踐中，當(dāng)原有勞動合同即將期滿時，用人單位應(yīng)以明示的方式通知勞動者，否則，很容易造成新勞動合同未簽，原勞動合同已期滿，勞動者仍然在用人單位繼續(xù)工作，勞動關(guān)系以原勞動合同相關(guān)約定存續(xù)著。此種情況下，雖然看似雙方默示約定，但用人單位往往會很被動，甚至承擔(dān)意料之外的法律風(fēng)險。
二、事實勞動關(guān)系中用人單位面臨的法律風(fēng)險
（1）用人單位新聘用員工，不依法簽訂書面勞動合同的，將面臨支付“雙倍工資”的風(fēng)險。依據(jù)《勞動合同法》及相關(guān)實施條例規(guī)定，用人單位與勞動者應(yīng)當(dāng)自用工之日起一個月內(nèi)訂立書面勞動合同，超過一個月不滿一年未與勞動者訂立書面勞動合同的，應(yīng)當(dāng)向勞動者每月支付兩倍的工資。（2）若用人單位與勞動者之間的事實勞動關(guān)系超過一年的，默認(rèn)為雙方之間成立了無固定期限勞動合同。依據(jù)《勞動合同法》及相關(guān)實施條例規(guī)定，用人單位自用工之日滿一年未與勞動者訂立書面勞動合同的，自用工之日起滿一年的當(dāng)日視為已經(jīng)與勞動者訂立了無固定期限勞動合同，并應(yīng)當(dāng)立即與勞動者補(bǔ)訂書面勞動合同。用人單位不簽書面勞動合同往往是希望逃避法律義務(wù)，有更靈活的用人權(quán)，而從法律的規(guī)定可見，不與勞動者簽訂勞動合同，用人單位不僅獲得不了靈活的用人權(quán)，還會得不償失，一旦成立無固定期限，用人權(quán)將會受到極大限制，勞動者獲得的將是類似于“鐵飯碗”的穩(wěn)定工作，只有符合法定解除勞動合同情形，用人單位才能解聘勞動者。（3）對于勞動合同到期后沒有續(xù)簽而勞動用工關(guān)系仍然存續(xù)的，勞動者除了可能獲得雙倍工資、無固定期限勞動合同外，還可能獲得解除勞動合同的經(jīng)濟(jì)補(bǔ)償金。（4）缺乏書面勞動合同，用人單位將面臨無法有效約束勞動者“誠信義務(wù)”的法律風(fēng)險。根據(jù)勞動法律的規(guī)定，勞動者有“誠實履約”、“忠于本職”、“保守商業(yè)秘密”和“競業(yè)禁止”等誠信義務(wù)。在事實勞動關(guān)系中，因雙方之間沒有簽訂書面勞動合同，往往無法將這些義務(wù)的內(nèi)容和違約責(zé)任具體化、明確化，達(dá)到有效約束員工行為，保障用人單位利益的目的。
綜上，在《勞動合同法》頒布實施后，其系列法律法規(guī)加重了用人單位在事實勞動關(guān)系中的法律責(zé)任和違法成本。因此，用人單位明智之舉應(yīng)該是依法行事，及時與勞動者建立勞動關(guān)系，有效規(guī)避事實勞動關(guān)系帶來的法律風(fēng)險。
三、防范因事實勞動關(guān)系引發(fā)勞資糾紛的建議
（1）作為國家管理層面，一方面要從立法上不斷完善對事實勞動關(guān)系的 保護(hù)；另一方面，勞動行政主管部門和司法部門，對事實勞動關(guān)系案件，用人單位有過錯的，及時查處，及時審理，及時處罰。（2）作為用人單位，上至單位領(lǐng)導(dǎo)者，下至人力資源管理人員，思想觀念要正確，要知法守法、依法行事，不可存逃避法律義務(wù)的僥幸心理。（3）用人單位要建立健全勞動關(guān)系管理制度。具體體現(xiàn)在：其一，用人單位與勞動者建立勞動關(guān)系應(yīng)當(dāng)及時訂立書面勞動合同，勞動者拒不簽訂勞動合同的，應(yīng)當(dāng)及時采取相關(guān)措施或通知勞動者解除雙方勞動關(guān)系，針對特殊崗位的員工，用人單位應(yīng)建立特殊的管理制度，并及時有效的執(zhí)行，才能降低企業(yè)勞動人事法律風(fēng)險的發(fā)生。其二，要強(qiáng)化招聘流程的科學(xué)性。很多單位在員工招聘中出于考察擬聘勞動者能力、用工節(jié)約成本等目的，往往采取“先上崗試用，后簽約轉(zhuǎn)正”的方式，從而增加了產(chǎn)生事實勞動關(guān)系的風(fēng)險。解決途徑就是要改變傳統(tǒng)招聘流程，做到“先簽約，后上崗”，以避免超過法定簽約期，支付“雙倍工資”的風(fēng)險。如果勞動者處于個人目的，故意拖延不簽訂勞動合同的，應(yīng)該及時書面通知勞動者終止勞動關(guān)系。其三，健全工作制度，做到合同檔案管理規(guī)范化。員工勞動合同實行科學(xué)規(guī)范、動態(tài)管理，專人負(fù)責(zé)，及時審查，未簽的及時補(bǔ)簽，勞動合同即將期滿該續(xù)簽的續(xù)簽，該終止的提前書面通知。其四，相關(guān)責(zé)任人要實行問責(zé)制。一旦因為部門或具體負(fù)責(zé)人員故意或失誤造成不簽、漏簽勞動合同，給單位造成相應(yīng)損失的，應(yīng)追究相關(guān)人員的責(zé)任。（4）作為勞動者，要有強(qiáng)烈的權(quán)利意識。當(dāng)合法權(quán)益受到侵害時，勞動者要勇于用法律武器維護(hù)自身權(quán)益；但是，勞動者也不可目光短淺，滿足于眼前利益，惡意用法，故意不簽勞動合同。另外，事實勞動關(guān)系往往舉證困難，作為弱勢群體，勞動者要注意相關(guān)證據(jù)的留存。
總而言之，用人單位勞動用工法律風(fēng)險是其在招聘及用人過程中存在的重要風(fēng)險之一，在目前《勞動合同法》、《工資支付條例》的立法總體重于保護(hù)勞動者利益的環(huán)境下，用人單位應(yīng)當(dāng)重視和理解包括《勞動合同法》在內(nèi)的法律法規(guī)，不斷提高防控勞動用工法律風(fēng)險的能力，促進(jìn)勞資雙方共同和諧發(fā)展，實現(xiàn)互利共贏。
參考文獻(xiàn)：
關(guān)鍵詞：合同管理；法律風(fēng)險；防范措施
建設(shè)工程合同通常是發(fā)包方和承包方進(jìn)行工程承發(fā)包的重要法律形式，是進(jìn)行工程施工、監(jiān)理和竣工驗收的主要法律依據(jù)。建設(shè)工程合同的訂立到最終的履行,對合同雙方的根本利益都有直接的影響。合同一旦訂立，就確立了當(dāng)事人雙方對工程項目的管理責(zé)任和雙方的經(jīng)濟(jì)法律關(guān)系，也是雙方實施工程管理，享有權(quán)利和承擔(dān)義務(wù)的法律依據(jù)。合法、有效的合同，更讓會當(dāng)事人認(rèn)真履行，同時還可以有效地預(yù)防糾紛的發(fā)生。一旦發(fā)生糾紛，當(dāng)事人也可以請求仲裁機(jī)構(gòu)或人民法院依據(jù)合同條款保護(hù)其合法權(quán)益。合同風(fēng)險是指在合同實施中環(huán)境、組織、技術(shù)、管理、業(yè)主信譽(yù)等情況發(fā)生變化導(dǎo)致承包商經(jīng)營失利而遭受的損失。合同條款中潛伏的風(fēng)險通常表現(xiàn)為責(zé)任不清、權(quán)利不明所致。認(rèn)真分析研究合同實施過程中的各種風(fēng)險因素，在簽訂工程承包合同時盡量避免承擔(dān)風(fēng)險的條款，最終采取有效地措施，都可以有效地防范工程承包中法律風(fēng)險的發(fā)生。
1 合同里存在的法律風(fēng)險
1．1合同主體不合格的主體，必須要是具有相應(yīng)的民事權(quán)利能力和民事行為能力的合同當(dāng)事人。合同主體不合格通常包括兩種情況，一種是雖然具有上述兩種能力，但不是合同當(dāng)事人，即當(dāng)事人錯位，當(dāng)然是不合格的合同主體。另一種是雖然是合同當(dāng)事人，可是沒有上面的兩種能力，同樣是不合格的合同主體。合同的主體就是工程的發(fā)包方和承包方，合同主體不當(dāng)之處主要表現(xiàn)在：工程發(fā)包方和承包方缺乏合同履約意識，既不認(rèn)真研究制訂合同條款，又不嚴(yán)格履行合同。在合同履約過程中由于缺少制約手段，違約情況比較嚴(yán)重，導(dǎo)致合同雙方當(dāng)事人的合法權(quán)益得不到應(yīng)有的保護(hù)，工程進(jìn)度、工程質(zhì)量也難以得到有效的保證。
1．2合同條款不平等工程承包原則上應(yīng)以合同為約束依據(jù)，而合同的重要原則之一就是平等性?？墒窃诠こ坛邪鼘嵺`中，業(yè)主與承包商往往沒有平等可言。經(jīng)過對當(dāng)前的工程承包買方市場的特點(diǎn)的分析，少數(shù)業(yè)主往往會借助僧多粥少這一有利的優(yōu)勢，對承包商蠻不講理，尤其是政府投資工程項目的業(yè)主部門。在簽訂承包合同時，業(yè)主通常會強(qiáng)加各種不平等條款，賦予業(yè)主各種不應(yīng)有的權(quán)力，而對承包商則只強(qiáng)調(diào)應(yīng)履行的義務(wù)，不提其應(yīng)享有的權(quán)利。例如索賠條款本來是合同的主要內(nèi)容，可是在多數(shù)合同中卻閉口不提；又如誤期罰款條款，基本上所有合同中都有詳細(xì)規(guī)定，而且罰的制度極嚴(yán)。承包商如果在擬定合同條款時不堅持合理要求，就會給自己留下很大的隱患。
合同文字不嚴(yán)謹(jǐn)就是不準(zhǔn)確，較容易引發(fā)歧義和誤解，致使合同難以履行或引發(fā)爭議。依法訂立的有效合同，必須真實的反映合同雙方的意愿。而這種反映只有靠準(zhǔn)確、明晰的文字來體現(xiàn)。可以說，合同講究咬文嚼字。但有些合同由于一些人為的或客觀的原因，對一些合同條款拿捏不準(zhǔn)或措辭含混不清。還有些合同對承包商的義務(wù)規(guī)定得非常具體，而對其應(yīng)享有的權(quán)利則籠統(tǒng)地一筆帶過，甚至對有些關(guān)鍵事項含糊其詞。比如有些工程承包合同中在有關(guān)追加款額的條款中寫道：“發(fā)生重大設(shè)計變更可增加款額”這類字句。那么，何為重大設(shè)計變更則并無細(xì)則說明。如果發(fā)生類似情況，業(yè)主或監(jiān)理工程師往往便會視情隨意曲解。
合同內(nèi)容不完備甚至有的使用境外文本。因為國情不同、語言文字不同，加上翻譯問題，使得這些合同文本存在很多疑問。特別是發(fā)展中國家的合同，因為這些國家過分強(qiáng)調(diào)獨(dú)立自創(chuàng)，往往不愿意沿用國際上普遍遵循的條款，而他們自己制定的一些法規(guī)或合同條例一般都不完善，遺漏事項頗多。導(dǎo)致在合同履約過程中，承包商經(jīng)常找不到合法依據(jù)來保護(hù)自己的利益。
合同管理不到位，少數(shù)合同管理人員的業(yè)務(wù)素質(zhì)很低，對工程承包合同風(fēng)險防范意識不強(qiáng)，致使在合同履約過程中遭受到一些本可避免的損失。有的沒有及時發(fā)出應(yīng)當(dāng)發(fā)出的文件，給以后索賠造成困難。有的對合同簽證確認(rèn)不重視，對應(yīng)簽證確認(rèn)的沒有辦理簽證確認(rèn)，當(dāng)發(fā)生糾紛時，因無法舉證而敗訴。有的對拖欠工程款的情況應(yīng)當(dāng)追究的沒有及時追究，當(dāng)訴諸法律時才發(fā)現(xiàn)已超過了訴訟時效，致使損失無法挽回。有的對發(fā)包方不按合同約定支付工程進(jìn)度款，一味地怕單方面停工承擔(dān)違約責(zé)任而不敢行使抗辯權(quán)，結(jié)果客觀上造成了墊資施工，使發(fā)包方的欠款數(shù)額越來越大，問題更加難以解決。
2 預(yù)防法律風(fēng)險的主要對策
2．1 建立健全合同管理的組織網(wǎng)絡(luò)，做到建設(shè)工程合同管理專業(yè)化、正規(guī)化，使建筑企業(yè)合同管理覆蓋企業(yè)的每個層次，延伸到各個角落。制訂本企業(yè)的合同管理制度，檢查監(jiān)督本企業(yè)各類建設(shè)工程合同的訂立、履行是建筑企業(yè)內(nèi)部合同管理機(jī)構(gòu)的主要職責(zé)；它的職責(zé)還有：宣傳貫徹有關(guān)合同法律、法規(guī)培訓(xùn)合同管理人員；審查合同，防止利用合同進(jìn)行違法活動；參與解決合同糾紛；總結(jié)推廣合同管理經(jīng)驗等等。合同管理人員的組成必須以法律顧問為核心，成員主要是企業(yè)的管理人員和購銷人員。要在企業(yè)負(fù)責(zé)人領(lǐng)導(dǎo)下開展工作，還要接受負(fù)責(zé)管理合同的國家有關(guān)行政主管部門的指導(dǎo)監(jiān)督。
2．2 建立健全合同管理的制度網(wǎng)絡(luò)制度網(wǎng)絡(luò)，首先是指企業(yè)就合同管理過程中的每個環(huán)節(jié)，建立和健全具體的、可操作的規(guī)章制度，使合同管理有章可循。其次是指建筑企業(yè)各層次都應(yīng)有自己的合同管理制度。合同管理制度是合同管理活動及其運(yùn)行過程的行為規(guī)范。合同管理能否成功的關(guān)鍵在于合同管理制度是否健全。制訂合同管理制度，是搞好建筑企業(yè)合同管理的重要保證。這些合同管理制度主要包括：合同歸口管理制度；合同審查制度；委托制度；合同考核制度；合同用章管理制度；合同臺帳、統(tǒng)計及歸檔制度。與此同時，還必須把這些合同管理制度與建設(shè)工程合同投標(biāo)報價、工程項目管理的全過程有機(jī)結(jié)合起來，貫穿于整個工程項目建設(shè)的始終。
1 發(fā)病癥狀
茄子苗期、成株期都可發(fā)病。葉、莖、花、果實均可受害,但主要危害果實。幼苗染病,莖基部或中部初現(xiàn)暗褐色水漬狀病斑,病情發(fā)展快,常腐爛,繼而幼莖變軟縊縮,致幼苗猝倒樣死亡。葉片發(fā)病,初期產(chǎn)生褐綠色不規(guī)則形或近圓形水漬狀較大的病斑,后漸變?yōu)榘岛稚?并在病部上可見較明顯的輪紋。濕度高時病斑上可見稀疏白霉長出,但病健界處不明顯,只有在氣候干燥時病斑邊緣才明顯,無白霉長出,并易干枯破裂。莖稈受害,初呈褐綠色或紫褐色水漬狀病斑,后莖稈漸漸縊縮軟化而折倒,致使病部以上枝葉垂萎至死亡,潮濕時病部可見著生的稀疏白霉?；ㄆ魇芎?多表現(xiàn)褐色腐爛,并向莖部蔓延危害。近地面的茄果易先發(fā)病,在茄果表皮初顯褐黃色至褐黑色近圓形水漬狀斑點(diǎn),病部略凹陷、軟腐并帶有皺褶,病緣不明顯。隨后病斑蔓延迅速,造成整個茄果被侵染危害,茄果肉呈淡褐色腐爛狀,氣候潮濕時茄果病處著生大量白色棉絮狀濃密霉層,并能使全茄果都長滿,但干燥時只見少而稀疏霉或無霉。病茄果易脫落在地上,在潮濕地面上病情會繼續(xù)發(fā)展,很快造成茄果上長滿白霉、腐爛;在干燥地上病茄果會逐漸腐爛失水,干縮變成褐黑色僵果。
2 病原形態(tài)
引起茄子綿疫病的病原菌有多個,均屬于鞭毛菌門真菌。常見的病菌是寄生疫霉(Phytophthora parasitica Dast.)和辣椒疫霉(P. capsici Leon.)。菌絲白色棉絮狀,分枝多,無隔,氣生菌絲發(fā)達(dá)。孢囊梗無色纖細(xì),分枝極少,無隔膜。孢子囊無色或稍黃,球形、卵圓形或長卵圓形,大小為 20~50 μm × 30~70 μm;孢子囊頂端明顯有狀突起,大小為5.8 μm×6.2 μm。菌絲頂端或中間會有大量黃色圓球形厚垣孢子產(chǎn)生,直徑 20~40 μm,壁厚 1.3~2.5 μm,單生或串生。
3 發(fā)病規(guī)律
3.1 侵染循環(huán)途徑
病菌的卵孢子經(jīng)安全越冬后,在來年的茄子生長期,通過雨水濺擊或灌水傳播到近地面的茄株、茄葉或茄果上,從表皮直接侵入或傷口處侵入,進(jìn)而侵染危害茄子。病斑上產(chǎn)生的游動孢子借助風(fēng)雨或水流進(jìn)行再傳播侵染危害,周而復(fù)始,擴(kuò)大侵染流行。秋后在病組織中形成卵孢子隨病殘體組織在土中越冬。
3.2 發(fā)病氣候條件
該病的發(fā)生適應(yīng)溫度范圍很廣,在8~40 ℃ 均可。最適宜病菌的發(fā)育、流行的氣候條件是溫度在25~35 ℃、相對濕度85% 以上。實踐中,在茄子整個生長結(jié)果期間,氣溫較易滿足病菌生長流行的需求,因此影響該病發(fā)生早晚、輕重、流行的決定性因素主要是濕度。在適宜的氣候條件下,病菌經(jīng)1~3 d繁殖即可再侵染茄果。在夏季雨季,田間的濕度大,特別是時晴時雨的梅雨天或高溫悶熱天氣,以及暴風(fēng)雨后突然放晴有利于該病的發(fā)生與流行。一般在大雨后的2~3 d,茄子綿疫病往往呈現(xiàn)田間發(fā)病流行高峰。各年度間發(fā)病程度存在較大差異,發(fā)病重且早、損失大的年份往往是雨季出現(xiàn)早、雨日與雨量均多。各地發(fā)病時間也因氣候不同有明顯差別,南方地區(qū)常在5—6月的梅雨季節(jié)及8—9月發(fā)生流行,所以春茄子易遭受嚴(yán)重危害;北方地區(qū)則在7—8月的雨季時易發(fā)生流行。
3.3 栽培技術(shù)影響
在設(shè)施栽培生產(chǎn)中,由于大棚塑料薄膜滴水或破損漏雨而引起發(fā)病。另外,土質(zhì)黏重、連茬種植、管理粗放、地勢低洼、地下水位高、雨后積水、排水不良、過度密植、偏施氮肥、雜草叢生的地塊和連續(xù)陰雨的年份發(fā)病較重。植株生長郁閉、嫩綠,田間通風(fēng)透光性不良,也有利于病害發(fā)生。
4 防控技術(shù)
4.1 選用適宜的抗病品種
種植抗病或耐病品種是預(yù)防茄子綿疫病發(fā)生流行的重要措施之一。抗病性在茄子品種間有明顯差異,圓茄種類一般比長茄種類有抗性,厚皮種類一般比薄皮種類有抗性,早熟種類一般比晚熟種類有抗性。抗病或耐病性較好的品種有‘布利塔茄’、‘湘茄4號’、‘寧茄8號’、‘興城紫圓茄’、‘長野狼茄’、‘北京九葉茄’、‘遼茄3號’、‘黑驃茄’等。
4.2 壯苗定植
有條件的地方可采用有機(jī)基質(zhì)穴盤育苗,培育的秧苗不僅根系發(fā)達(dá),抗病性強(qiáng),并能避免苗床、育苗營養(yǎng)土帶菌問題,減少病菌侵染機(jī)率。定植時堅持選用健壯茄苗,不用病殘茄苗,移栽時盡量帶土少傷根,不給病菌侵染的機(jī)會。茄苗健壯標(biāo)準(zhǔn):茄株高度17~20 cm,莖稈粗度0.8~1 cm,節(jié)間長1.3~1.5 cm,真葉有7~8片,葉片深綠色且大而厚,葉間展開度大于株高,生有即將開放的大花蕾,根系呈白色。
4.3 實行換茬輪作
與非茄科作物如十字花科、豆科、葫蘆科等實行2年以上輪作,忌重茬。秋冬深翻土層進(jìn)行冷凍曬垡。選擇地勢較高、排灌方便、沙質(zhì)壤土地塊種植。土地要平整,雨季注意及時排水,做到雨后無積水。
4.4 提倡地膜覆蓋栽培及合理密植
覆蓋地膜可有效阻止土中病菌飛濺傳播到茄子上,并利用日光增溫進(jìn)行高溫滅菌及控雜草生長。依各地自然條件,可選用深溝窄高畦或半高畦栽培方式,溝渠一定要保持通暢,便于田間排水降濕。茄子種植密度要適宜,株行距一般為50 cm × 60 cm,每667 m2種植 2 200~2 500株。種植太密,田間通透性不良,茄株生長軟弱,易感病。
4.5 加強(qiáng)田間管理
基肥中農(nóng)家肥必須經(jīng)充分腐熟后再施用,磷鉀肥應(yīng)適當(dāng)增施,追肥要及時。水分管理切忌大水漫灌,在茄子定植時應(yīng)澆足穴水,蹲苗時適當(dāng)控水,緩棵后澆水要濕干相見,有利提高植株抗病力。可采用滴灌等灌溉方式,降低病菌隨灌溉水傳播。為防止茄株側(cè)倒觸及地面,可插竹竿綁定茄株,及時摘除茄株下部老葉,門茄坐果后適時打掉門茄以下側(cè)枝,改善田間通風(fēng)透光條件,有利于降低田間相對濕度,促進(jìn)植株健壯生長。剛發(fā)病時要隨時去除病葉或病果,清潔田園的殘株落葉,將病殘體攜帶出田外集中深埋或燒毀,以防病菌再次傳播侵染。
關(guān)鍵詞：氯噻啉 多克隆抗體 時間分辨免疫分析
中圖分類號：S482 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-5336（2013）24-0000-00
氯噻啉（imidaclothiz）是我國公司自主研發(fā)一種新煙堿類殺蟲劑，與常規(guī)殺蟲劑沒有交互抗性，因而可用于抗性治理，廣泛應(yīng)用于那些對有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類、除蟲菊酯類已產(chǎn)生抗性的農(nóng)林業(yè)害蟲的防治[1]。由于其具有高效、廣譜、低毒等優(yōu)點(diǎn)，氯噻啉使用量日益上升，不合理的使用也經(jīng)常出現(xiàn)，對環(huán)境造成很大壓力，因此，研制快速廉價、靈敏度高、穩(wěn)定性好和篩通量大的檢測氯噻啉殘留的常規(guī)方法，加強(qiáng)對氯噻啉藥物的檢測和控制是一項刻不容緩的工作。
目前，有關(guān)氯噻啉殘留檢測方法主要是高效液相色譜法（HPLC）[2-4]。但前處理過程比較繁瑣，檢測結(jié)果受樣品凈化、濃縮等步驟的影響，不適合進(jìn)行批量樣品的快速檢測。而免疫分析技術(shù)具有很高的精確度、更靈敏的反應(yīng)，更強(qiáng)的特異性、不高的技術(shù)要求、更短的檢測時間和大批量測定等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到人們的重視。抗氯噻啉農(nóng)藥的多克隆抗體的酶聯(lián)免疫分析技術(shù)（ELISA）也有報道[5]，然而該方法檢測靈敏度不太理想。時間分辨免疫分析技術(shù)具有高靈敏性、高選擇性、快速等優(yōu)點(diǎn)，可以彌補(bǔ)普通ELISA免疫分析技術(shù)靈敏度的不足。本研究建立了氯噻啉的TRFIA殘留檢測方法，為環(huán)境與食品中痕量氯噻啉殘留高靈敏檢測提供技術(shù)支持。
1 材料與方法
1.1 材料
96孔聚苯乙烯熒光板（江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所）；95%氯噻啉原藥（南通江山農(nóng)藥化工股份有限公司）；卵清蛋白（OVA）、正三丁胺、氯甲酸異丁酯（Sigma公司）；Eu3+標(biāo)記盒為PerkinElmer公司產(chǎn)品；熒光增強(qiáng)液，（江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所）；碳酸鹽緩沖液（CBS）：0.05M，pH 9.6；磷酸鹽緩沖液（PBS）：0.01M，pH 7.4；氯噻啉多克隆抗體為本實驗自行制備；二甲亞砜（DMSO）、N，N-二甲基甲酰胺、磷酸二氫鉀、氫氧化鉀等試劑均為分析純。
1.2包被原的合成
氯噻啉的半抗原合成參照文獻(xiàn)[5]，將合成的半抗原與卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)通過混合酸酐法制備包被抗原。反應(yīng)液用PBS在4℃下透析3天。根據(jù)三者在280 nm的摩爾吸光系數(shù)（ε）估算半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)比[10]：結(jié)合比=（ε偶聯(lián)物-ε載體蛋白）/ε半抗原。
1.3 包被板的制備
包被抗原用0.05 M pH 9.6 CBS溶液稀釋至5 μg /mL，加入到96孔微孔板中（100 μL /孔），4℃包被過夜，棄去包被液，加入封閉液，每孔200μL，37 ℃孵育2h，棄去封閉液，真空抽干，-20℃冷凍保存。
1.4 Eu3 + 標(biāo)記抗體的制備
取適量的PBS溶解的抗氯噻啉的抗體，在4℃下碳酸鹽緩沖液（0.05 M，PH 8.5）透析2次，每次24h，目的是除去溶液中NaN3并且轉(zhuǎn)換成碳酸鹽緩沖液。在碳酸鹽緩沖液環(huán)境中用DTTA-Eu3+標(biāo)記抗體。取0.5 mg上述透析的抗氯噻啉的抗體加入含0.2 mg 的DTTA- Eu3+的小瓶中，室溫下磁力攪拌反應(yīng)24 h。將Eu3 +標(biāo)記抗體溶液加入到Sephadex G-50層析柱中，用含0.9% NaCl的Tris-HCl洗脫液洗脫。收集層析柱流出液（ 1mL/管），逐管測量其吸光值（A280 nm），合并峰管。以Eu3+標(biāo)記試劑盒說明書提供的方法測定并計算抗體標(biāo)記率。
1.5 回收率的測定
河水經(jīng)過濾，添加不同濃度（0.05-0.5 mg/L）的氯噻啉標(biāo)樣，用含甲醇的PBS稀釋，直接用于TRFIA測定。稱取10g土壤，添加不同濃度（0.05-0.5 mg/kg）的氯噻啉標(biāo)樣，靜置一段時間，加入40mL二氯甲烷進(jìn)行超聲提取，4000 r/min離心。取上清液20 mL減壓濃縮，用含甲醇的PBS定容到10mL。每個處理設(shè)3個重復(fù)，各設(shè)一個空白對照，用建立的TRFIA法對樣品進(jìn)行分析。
1.6 分析測定
取準(zhǔn)備好的酶標(biāo)板，加入50μL的氯噻啉標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣品溶液到酶標(biāo)孔中，加Eu3 + 標(biāo)記抗氯噻啉抗體（50 mmol/L pH 7.4的PBS稀釋）100μL，室溫振蕩孵育30 min，用含0. 1% 吐溫-20的Tris-HCl（50 mmol /L pH 7.8）洗滌液洗6次。加200μL 增強(qiáng)液，振蕩孵育5 min 后，用熒光檢測儀進(jìn)行測定。
2結(jié)果與分析
2.1包被原的鑒定
對氯噻啉半抗原、OVA及偶聯(lián)物進(jìn)行紫外全波長掃描，發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)物的紫外吸收光譜具有載體蛋白和半抗原的紫外吸收特征，說明偶聯(lián)成功，如圖1所示。根據(jù)它們在280 nm波長下的摩爾吸光系數(shù)估算得到包被原的結(jié)合比為8.5：1。
2.2 Eu3 +標(biāo)記率
Eu3+標(biāo)記抗體溶液經(jīng)Sephadex G-50層析，用離心管收集出現(xiàn)的第1洗脫峰，以PerkinElmer公司提供的Eu3+標(biāo)準(zhǔn)為參考，計算得出第1洗脫峰的Eu3+含量為22.4 μmol /L，蛋白質(zhì)含量為4.7 μmol /L，即平均每個免疫球蛋白分子上標(biāo)記了4.8個Eu3 +。
2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
各參考標(biāo)準(zhǔn)品濃度以及熒光值建立氯噻啉的標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程為Y=-2.292X-3.0874， IC50為0.0447 mg/L，最低檢測限為0.005 mg/L。 圖2表明本試劑具有良好的劑量-反應(yīng)線性關(guān)系。
2.4 抗體的特異性
用TRFIA在相同的條件下測定氯噻啉和結(jié)構(gòu)類似煙堿類殺蟲劑對抗體的交叉反應(yīng)，計算各自的IC50和交叉反應(yīng)率CR（表1），結(jié)果表明得到的抗體對氯噻啉有較好的特異性，與大部分殺蟲劑的幾乎沒有交叉。
2.5 回收率測定
在河水和土壤中添加不同濃度的的氯噻啉標(biāo)樣，按照TRFIA進(jìn)行回收率測定，檢測結(jié)果見表2。在水和土壤中分別添加氯噻啉標(biāo)準(zhǔn)溶液，平均回收率為81.7%～103.8%，變異系數(shù)為3.9%～10%，符合農(nóng)藥殘留檢測要求。
3 討論
本文基于多克隆抗體建立了氯噻啉TRFIA免疫分析方法。其靈敏度（IC50）較先前報道的ELISA[5]有了很大的提高（大約5倍），方法的抑制中濃度可達(dá)到0.0447 mg/L?？梢奣RFIA法檢測氯噻啉比ELISA 法靈敏度上具有明顯優(yōu)勢。時間分辨熒光免疫分析具有示蹤物穩(wěn)定、無放射性污染、靈敏度高、操作簡便、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬、不受樣品自然熒光干擾、標(biāo)記物儲存時間長等優(yōu)點(diǎn)[6-9]，使得試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線飄移小，更提高了試劑的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。在研究抗體標(biāo)記和發(fā)光過程中發(fā)現(xiàn)：抗體的濃度與標(biāo)記效率和本底發(fā)光值成反比，高濃度標(biāo)記抗體，能夠提高靈敏度和降低本底，使我們建立方法所需要。本文建立的氯噻啉-TRFIA 法，與方松等人的報道在靈敏度上有了很大的提高，可以用于環(huán)境與食品中痕量氯噻啉的檢測需求。
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一、基層央行依法行政中的問題及隱含的法律風(fēng)險
（一）法律監(jiān)督力量薄弱，依法行政工作運(yùn)行體制不夠順暢。目前縣支行的大多數(shù)法律事務(wù)人員需要承擔(dān)辦公室其他行政管理工作，無法將精力集中于法律事務(wù)工作，從而難以發(fā)揮法律事務(wù)人員在推進(jìn)依法行政工作中的統(tǒng)籌、協(xié)調(diào)作用，影響了對依法行政工作的指導(dǎo)和監(jiān)督水平。
（二）執(zhí)法人員法律知識欠缺，依法行政的能力和水平較低。
（三）對依法行政法律風(fēng)險認(rèn)識不到位。少數(shù)縣支行的個別部門和員工不能充分認(rèn)識到依法行政的嚴(yán)肅性，對于什么是依法行政，為什么要依法行政，如何做到依法行政認(rèn)識模糊。
（四）依法行政流程控制環(huán)節(jié)銜接不夠規(guī)范。個別部門少數(shù)員工責(zé)任意識不強(qiáng)，不能按照人民銀行總分行制定的操作流程依法行政，執(zhí)法過程中憑經(jīng)驗和習(xí)慣辦事，員工之間相互配合不夠默契，銜接不順暢，導(dǎo)致現(xiàn)場檢查個別環(huán)節(jié)缺失、行政處罰檔案資料不全等現(xiàn)象發(fā)生。
（五）依法行政監(jiān)督檢查機(jī)制不夠完善?？h支行個別部門負(fù)責(zé)人對本部門依法行政情況的監(jiān)督檢查存在薄弱環(huán)節(jié)。依法行政管理部門對執(zhí)法職能部門執(zhí)法行為合法合理性監(jiān)督檢查的頻度和深度也嫌不足。
（六）依法行政橫向信息溝通不夠暢通。執(zhí)法部門負(fù)責(zé)人、執(zhí)法人員、法律事務(wù)人員之間未能建立有效的信息溝通渠道。個別員工無執(zhí)法證參加執(zhí)法活動，執(zhí)法部門負(fù)責(zé)人和法律事務(wù)人員在進(jìn)行現(xiàn)場檢查立項審批時也未核實檢查組成員的執(zhí)法資格。基層人民銀行與地方政府相關(guān)部門的工作協(xié)調(diào)與信息共享溝通聯(lián)動機(jī)制也不夠健全。
二、防范基層央行法律風(fēng)險的措施
基層人民銀行要嚴(yán)格按照法律規(guī)定的權(quán)限和程序開展行政執(zhí)法工作，確保依法行政工作做到既不能失職不作為，又不能越權(quán)亂作為，有效防止依法行政權(quán)力失控、決策失誤等問題發(fā)生。建議：
（一）加強(qiáng)依法行政工作組織領(lǐng)導(dǎo)。人民銀行縣支行要進(jìn)一步加強(qiáng)對依法行政工作的組織領(lǐng)導(dǎo)，有關(guān)領(lǐng)導(dǎo)小組及領(lǐng)導(dǎo)小組辦公室要切實履行職責(zé)。
（二）加強(qiáng)行政執(zhí)法人員隊伍建設(shè)?；鶎尤嗣胥y行要把加強(qiáng)行政執(zhí)法人員隊伍建設(shè)作為推進(jìn)依法行政的一項基礎(chǔ)性工作。
（三）增強(qiáng)行政執(zhí)法人員法制觀念?；鶎尤嗣胥y行要加大對執(zhí)法人員職業(yè)責(zé)任、職業(yè)道德、職業(yè)紀(jì)律和法律風(fēng)險的教育引導(dǎo)力度，提高執(zhí)法人員法律風(fēng)險防范意識。
（四）加強(qiáng)行政執(zhí)法檢查流程控制?；鶎尤嗣胥y行要加強(qiáng)宣傳教育，使行政執(zhí)法人員按照人民銀行法賦予的權(quán)利，依法履行行政檢查監(jiān)督職責(zé)，確保依法行政操作流程有效銜接。
關(guān)鍵詞：勞動紀(jì)律 管理 檢查
大慶石化公司煉油廠作為建廠50多年的老廠，作為煉油化工企業(yè)，裝置連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)，操作工實行倒班工作制，這對于在崗員工的勞動紀(jì)律、工作狀態(tài)有較高較嚴(yán)的要求。煉油廠多年來在員工管理、員工隊伍建設(shè)、調(diào)動員工工作積極性等諸多方面進(jìn)行了長期的努力與探索。尤其在員工勞動紀(jì)律管理方面，煉油廠歷任勞動紀(jì)律管理部門進(jìn)行了許多實踐，總結(jié)了許多方法，取得了一定的成效，為煉油廠50多年來的持續(xù)發(fā)展做出了貢獻(xiàn)。
隨著煉油廠的不斷發(fā)展，煉油廠員工素質(zhì)不斷提高，工作環(huán)境、工藝條件等不斷變化，老的勞動紀(jì)律管理辦法有些已不適應(yīng)現(xiàn)在的管理要求，對于勞動紀(jì)律管理提出了新的挑戰(zhàn)。為了更好為煉油廠生產(chǎn)保駕護(hù)航，近年來煉油廠不斷總結(jié)經(jīng)驗，努力在原有管理模式的基礎(chǔ)上拓寬思路，探索了幾項勞動紀(jì)律管理辦法，加強(qiáng)煉油廠勞動紀(jì)律管理力度，提高員工工作積極性。
一、實行煉油廠總值班檢查掛牌制度
煉油廠長期以來都是由人事處一個部門進(jìn)行勞動紀(jì)律管理，受人員、工作性質(zhì)等限制檢查強(qiáng)度、管理力度都不盡如人意。煉油廠生產(chǎn)值班人員按規(guī)定在值班期間要求進(jìn)廠檢查2-3次，之前對于生產(chǎn)值班人員檢查內(nèi)容沒有明確要求，導(dǎo)致生產(chǎn)值班人員到車間崗位只是走過場、走形式。
為了強(qiáng)化煉油廠勞動紀(jì)律管理，提高總值班人員入廠檢查質(zhì)量，煉油廠人事處征得廠領(lǐng)導(dǎo)同意在2009年初制定辦法要求總值班進(jìn)行檢查掛牌。前期由煉油廠人事處從全廠各車間了解、征集、匯總操作服務(wù)崗位巡檢路線，并編制了《煉油廠崗位巡檢路線表》，并統(tǒng)一制作“煉油廠總值班巡檢牌”。煉油廠要求分廠總值班人員在其值班期間偕同一名調(diào)度室當(dāng)班人員或分廠值班人員進(jìn)行檢查。檢查人員到廠調(diào)度室領(lǐng)取“煉油廠總值班巡檢牌”，參考《煉油廠崗位巡檢路線表》隨機(jī)選擇車間、崗位進(jìn)行檢查掛牌（要求：掛牌地點(diǎn)需在崗位員工巡檢路線巡檢點(diǎn)上，掛牌前后不得通知崗位員工及車間相關(guān)人員），檢查后返回調(diào)度室將掛牌時間、地點(diǎn)等內(nèi)容填入《煉油廠生產(chǎn)值班巡檢表》。車間崗位操作人員巡檢發(fā)現(xiàn)煉油廠總值班巡檢牌后，電話通知煉油廠調(diào)度室，并于下班后將總值班巡檢牌返還調(diào)度室。車間崗位未在規(guī)定巡檢時間內(nèi)匯報調(diào)度室，視同未進(jìn)行巡檢掛牌，按照煉油廠經(jīng)濟(jì)責(zé)任制管理規(guī)定進(jìn)行考核。
該制度的實施有效加強(qiáng)了煉油廠勞動紀(jì)律管理力度，提高了參加生產(chǎn)值班廠各級領(lǐng)導(dǎo)干部的勞動紀(jì)律管理主動性、自覺性，有效提高生產(chǎn)值班人員崗位檢查質(zhì)量。同時通過生產(chǎn)值班檢查掛牌制度的實施，有效提高了各車間勞動紀(jì)律管理的重視力度，崗位員工巡檢的認(rèn)真程度得到極大提高，極大地提高了崗位員工的巡檢質(zhì)量。
二、實行煉油廠巡檢小循環(huán)制度
崗位操作工“巡檢”是其工作職責(zé)的一個重要組成部分，巡檢質(zhì)量的好壞將直接影響到裝置的平穩(wěn)、安全運(yùn)行。巡檢不認(rèn)真，放過一個安全隱患就有可能導(dǎo)致一起重大的安全生產(chǎn)事故，同樣巡檢認(rèn)真及時發(fā)現(xiàn)設(shè)備缺陷、事故先兆就可以避免一起重大安全生產(chǎn)事故。加強(qiáng)巡檢、提高巡檢質(zhì)量，一直是分廠、車間各級管理部門始終堅持、不懈努力的目標(biāo)。
煉油廠各操作服務(wù)崗位原巡檢路線根據(jù)各裝置生產(chǎn)實際情況設(shè)有若干個巡檢點(diǎn)，視為巡檢大循環(huán)。崗位操作工往往是沿巡檢路線例行公事性質(zhì)的掛牌，對于各巡檢點(diǎn)的巡檢內(nèi)容不注意檢查，巡檢存在應(yīng)付了事現(xiàn)象。為強(qiáng)化操作服務(wù)崗位巡檢管理，煉油廠在2009年7月根據(jù)巡檢大循環(huán)上每一個巡檢點(diǎn)周圍的若干項巡檢內(nèi)容設(shè)置相應(yīng)的巡檢旋轉(zhuǎn)牌（即巡檢小循環(huán)）。通過各車間上報關(guān)鍵巡檢點(diǎn)及所需巡檢旋轉(zhuǎn)牌個數(shù)，煉油廠人事處統(tǒng)計、匯總后，煉油廠設(shè)計并制作統(tǒng)一式樣的巡檢旋轉(zhuǎn)牌，發(fā)放到各車間崗位并指導(dǎo)安裝。崗位操作工巡檢過程中，到達(dá)每個巡檢點(diǎn)掛牌后，針對巡檢內(nèi)容進(jìn)行檢查并將該處的巡檢旋轉(zhuǎn)牌旋轉(zhuǎn)至當(dāng)時時間。巡檢小循環(huán)上的巡檢旋轉(zhuǎn)牌時間如與實際所應(yīng)巡檢時間不符，按未巡檢或巡檢不認(rèn)真處理。
巡檢小循環(huán)制度的實施迫使崗位員工巡檢時自覺按照要求檢查巡檢點(diǎn)的每一項內(nèi)容，有效防止巡檢走形式、走過場情況的發(fā)生，提高了崗位巡檢質(zhì)量。
三、實行煉油廠機(jī)關(guān)處室分組循環(huán)檢查制度
為了強(qiáng)化煉油廠勞動紀(jì)律管理，有效加強(qiáng)對基層車間勞動紀(jì)律的檢查力度，提高機(jī)關(guān)各部門對全廠勞動紀(jì)律管理意識，加深機(jī)關(guān)各部門間的相互協(xié)調(diào)配合，維護(hù)煉油廠正常生產(chǎn)秩序，煉油廠制定機(jī)關(guān)處室循環(huán)檢查制度。煉油廠將廠機(jī)關(guān)按處室分為10個勞動紀(jì)律檢查組，每三天一組，每組檢查人員不少于兩人，每組于每月固定三天中至少深入全廠基層車間、班組、崗位檢查勞動紀(jì)律一次（檢查時間、檢查方式自定），每次檢查崗位不少于八個，每組由專人將檢查結(jié)果報人事處。
此項措施實施的好處在于：加強(qiáng)了機(jī)關(guān)各部門的勞動紀(jì)律管理意識，勞動紀(jì)律檢查頻次增加，加大了全廠勞動紀(jì)律檢查范圍與管理力度。此項措施實施的不足在于：需加強(qiáng)各處室人員檢查勞動紀(jì)律的責(zé)任心。
四、各車間管理人員工作時間進(jìn)出廠登記抽查制度
煉油廠要求全廠各車間建立《管理人員進(jìn)出廠登記本》，在工作時間車間職能人員因公出廠必須在其上進(jìn)行登記備查（寫明出廠人姓名、出廠時間、原因），因私出廠需與車間主管領(lǐng)導(dǎo)請假并登記。各車間《管理人員進(jìn)出廠登記本》要求放置于方便拿到的地方，以方便隨時登記與檢查。煉油廠人事處將不定期在“大慶石化公司廠區(qū)門禁管理系統(tǒng)”上查詢某一時間段的煉油廠人員進(jìn)出廠記錄，并持此記錄到所涉及人員單位與該車間登記本進(jìn)行核對。車間登記本所登記出廠人員的姓名、時間與“門禁管理系統(tǒng)”中查詢記錄不一致或未登記，則按違紀(jì)處理。
五、車間每月上報勞動紀(jì)律自查結(jié)果制度
煉油廠多年來勞動紀(jì)律管理一直遵循的原則是分廠檢查，對于發(fā)現(xiàn)的違紀(jì)行為在全廠調(diào)度會上進(jìn)行通報，之后分廠考核、車間考核。一直以來，各車間都是被動的進(jìn)行勞動紀(jì)律管理，各車間勞動紀(jì)律管理積極性不高，大多遵循“分廠查出問題后車間借機(jī)很扣，分廠未查出問題則得過且過，應(yīng)付了事”。煉油廠長期通過檢查逼迫車間加強(qiáng)勞動紀(jì)律管理，一直在探索行之有效的方式、方法來提高各車間勞動紀(jì)律管理的積極性，但始終未找到好的解決方法。
煉油廠要求各車間加強(qiáng)勞動紀(jì)律管理，每月25日前將各自車間勞動紀(jì)律檢查情況進(jìn)行整理、匯總，并上報煉油廠人事處。對于不按時上報勞動紀(jì)律檢查情況，按車間未進(jìn)行勞動紀(jì)律檢查處理，有分廠統(tǒng)一進(jìn)行考核。對于未按時上報勞動紀(jì)律檢查情況和上報檢查無違紀(jì)的車間，煉油廠將在下一月的勞動紀(jì)律檢查中進(jìn)行重點(diǎn)檢查。車間每月上報勞動紀(jì)律自查結(jié)果制度的實施，旨在督促各車間自覺重視勞動紀(jì)律管理，減輕分廠管理壓力，提高各車間勞動紀(jì)律管理的主動性、積極性。
勞動紀(jì)律管理是一項任重而道遠(yuǎn)的工作，是保證全廠員工隊伍穩(wěn)定、保持員工良好工作狀態(tài)的必要手段。為了煉油廠的長期發(fā)展，人力資源管理者必須不斷探索、不斷創(chuàng)新好的、行之有效的勞動紀(jì)律管理方法，保證企業(yè)的安穩(wěn)長滿優(yōu)運(yùn)行。
參考文獻(xiàn)：
【摘要】 目的 選擇理想的非特異性抗原封閉方法以適應(yīng)基于免疫滲濾法的蛋白芯片制備。方法 以桿狀病毒-昆蟲表達(dá)系統(tǒng)制備的人瘤病毒16型(HPV16)L1蛋白抗原為例，采用脫脂奶粉、小牛血清、牛血清白蛋白及不同組合等5種方法對非特異性抗原進(jìn)行封閉，檢測其在免疫滲濾實驗中對消除非特異性染色的效果，尋找最佳封閉非特異性染色的方法。結(jié)果 經(jīng)過多次重復(fù)試驗，并以PBS代替血清作空白試驗，結(jié)果顯示，目前常用的先固相然后封閉的幾種方法，其封閉效果的穩(wěn)定性和重復(fù)性不佳，且空白對照易出現(xiàn)假陽性；同時發(fā)現(xiàn)使用脫脂奶粉做封閉劑封閉后，由于奶粉顆粒易堵塞NC膜的孔徑，影響NC膜的滲濾速度；使用小牛血清做封閉劑封閉后，由于NC膜對小牛血清的吸附而產(chǎn)生背景，影響結(jié)果判讀；而采用20g/L BSA先封閉后固相的方法，在實驗中得到滿意的結(jié)果。結(jié)論 先封閉后固相的方法，在免疫滲濾實驗中對非特異性抗原封閉的效果理想、結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好，為一種理想的新的封閉方法。
【關(guān)鍵詞】 免疫滲濾法；非特異性染色封閉方法；人瘤病毒16型(HPV16)
ChinaABSTRACT: Objective To select an optimal non-specific antigen blocking method by using immuno-infiltration assay so as to suit protein chip preparation. Methods Human papillomavirus type 16 L1 protein expressed by insect-baculovirus espressin system was incubated with skimmed milk powder， calf serum， bovine serum albumin (BSA) combinations of five kinds of methods to block the non-specific antigen. PBS was used as control. The effect of eliminating non-specific stain was detected by immuno-infiltration assay. Results After repeated tests， the results showed that the stability and repeatability of blocking effects were poor for the fixing up antigen first and then blocking method， and the blank control was prone to false positive. The infiltration rate of NC membrane would be affected by using skimmed milk powder as a blocking agent because the pore of NC membrane was easily plugged by milk powder particles. The use of calf serum as a blocking agent made it very difficult to determine the result because the calf serum absorbed by NC membrane produced the background; however， when 20g/L BSA was used to blocking before fixing up antibody， the results became satisfactory. Conclusion Fixing up antibody after blocking in immuno-infiltration assay showed that the blocking effect against non-specific antigen was satisfactory， stable and repeatable， indicating this method is a novel optimal blocking method compared with others.
KEY WORDS: immuno-infiltration; non-specific staining blocking method; human papillomavirus type 16
免疫滲濾法是以硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜為載體進(jìn)行快速免疫分析的方法[1]，它實際上屬于快速斑點(diǎn)免疫結(jié)合分析方法(dot immuneobinding assay， DIBA)中的一種，即免疫斑點(diǎn)滲濾分析(dot immunofiltration assay， DIFA)。該法通常是將抗原/或抗體固定于載體上，抗體/或抗原與膜表面固定的配基進(jìn)行反應(yīng)。該法靈敏度高(可達(dá)ng水平)，操作簡便、快速，不需特殊設(shè)備，目前在低密度蛋白芯片技術(shù)中應(yīng)用最多，但其非特異性著色卻是困惑應(yīng)用者的最大問題[2]。本研究以人瘤病毒16型(HPV16)L1VLP為抗原，對消除免疫滲濾法檢測相應(yīng)抗體時的非特異性染色方法進(jìn)行了探討，獲得了滿意的結(jié)果。
1 材料與方法
1.1 材料
HPV16L1病毒樣顆粒(VLP)、膠體金標(biāo)記的羊抗人IgG抗體由西安聯(lián)爾科技有限公司制備；硝酸纖維素膜(NC膜，孔徑0.45μm)購自美國Hybond公司；待測血清標(biāo)本來源于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院(宮頸癌確診患者40例，兒童血清10例)；即溶脫脂奶粉為黑龍江紐迪希亞營養(yǎng)制品有限公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白(BSA)購自華美生物工程公司；商品化HPV抗體檢測試劑盒購自加拿大Fulda Biomedical Inc；Tween 20購自美國Promaga公司；小牛血清購自杭州四季青生物材料工程公司。改良TBE洗滌液：Tris Base 54g、硼酸27.5g溶于500mL雙蒸水中，加0.5mol/L EDTA-Na2 20mL，調(diào)至pH8.0，補(bǔ)雙蒸水定容1000mL，加200mL 300g/L飽和硫酸銨[(NH4)2SO4]及40mL Tween 20和雙蒸水480mL，充分混勻后使用。
1.2 蛋白定量
雙縮脲法測定HPV抗原濃度，用生理鹽水調(diào)整蛋白濃度為1g/L。將抗原分成兩份，一份備用，一份直接應(yīng)用微矩陣點(diǎn)樣機(jī)。將HPV16抗原點(diǎn)樣于NC膜上，以人IgG(2g/L)為陽性質(zhì)控點(diǎn)，點(diǎn)間距為3mm，點(diǎn)樣量為100mL，并作定位標(biāo)記，自然風(fēng)干待檢 。
1.3 非特異性染色的封閉[3-5]
方法一：取抗原膜100份，浸入10g/L BSA＋0.5g/L Tween 20中，室溫振搖封閉2h，取出50份室溫風(fēng)干；另外50份繼續(xù)封閉4h后室溫風(fēng)干，待檢。方法二：取抗原膜100份，浸入50g/L脫脂奶粉中，室溫振搖封閉2h；取出50份，PBS漂洗2min，室溫風(fēng)干；4h后取另外50份，PBS漂洗2min，室溫風(fēng)干，待檢。方法三：取抗原膜100份，浸入50g/L BSA＋10g/L脫脂奶粉中，室溫振搖封閉2h；取出50份，PBS漂洗2min，室溫風(fēng)干；4h后取另外50份，PBS漂洗2min，室溫風(fēng)干，待檢。方法四：取抗原膜100份，浸入100mL小牛血清中，37℃封閉2h；取出50份室溫風(fēng)干，另外50份直接進(jìn)行免疫滲濾檢測。方法五：取 HPV16L1VLP(1mg/mL)50μL與等體積20g/L BSA混合，4℃過夜，按上述點(diǎn)樣方法點(diǎn)樣，待檢。
1.4 免疫滲濾實驗
參照文獻(xiàn)[6-7]將干燥的抗原膜片(點(diǎn)樣面朝上)裝入塑料滲濾夾具中，在待檢膜下襯墊吸水材料，壓緊滲濾夾，依次加洗滌液2滴，血清標(biāo)本50μL，洗滌液2滴，適度稀釋的膠體金標(biāo)記羊抗人IgG抗體2滴。每步間隔時間為所加試劑完全滲入后再進(jìn)行下一步。最后加洗滌液2滴，洗去未結(jié)合的膠體金。以PBS代替血清作空白對照。結(jié)果觀察：在膜中央出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)者為陽性，顏色稍淺者為弱陽性，否則為陰性。其下方的質(zhì)控對照點(diǎn)為實驗有效的標(biāo)志，無論陽性或陰性結(jié)果，對照線均應(yīng)顯示紅色。
2 結(jié) 果
以脫脂奶粉、BSA、Tween 20及小牛血清為封閉劑，以不同方法進(jìn)行封閉，檢測50例相同的血清標(biāo)本，每種封閉方法重復(fù)試驗5次，并以PBS代替血清作空白試驗。結(jié)果顯示，前4種先固相后封閉的方法，其結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性受到封閉溫度、時間及封閉劑濃度等因素變化的影響，且空白對照易出現(xiàn)假陽性；第2種和第3種加入脫脂奶粉的封閉方法，封閉后由于奶粉顆粒易堵塞NC膜的微孔，影響滲濾速度；小牛血清做封閉劑則由于NC膜對小牛血清的非特異吸附而產(chǎn)生背景，影響結(jié)果判讀。而采用20g/L BSA先與抗原共育后再點(diǎn)膜的方法，其封閉效果理想、結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好，為一種理想的新的封閉策略。
2.1 封閉效果檢驗
分別用免疫滲濾試驗(先封閉后固相的封閉方法)和商品化HPV抗體檢測試劑盒(按試劑盒說明書進(jìn)行)檢測40例宮頸癌患者血清和10例兒童血清，結(jié)果顯示，免疫滲濾試驗的靈敏度[82.5%(33/40)]和特異度[90%(9/10)]與商品化HPV抗體檢測試劑盒的靈敏度[85%(34/40)]和特異度[80%(8/10)]，經(jīng)Fisher確切概率法檢驗差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表1)。表1 免疫滲濾法與商品化試劑盒檢測HPV抗血清的結(jié)果比較（略）兩種不同方法檢測結(jié)果比較，P>0.05(Fisher確切概率法)。
2.2 特異性阻斷吸附試驗
隨機(jī)抽取5份陽性患者血清，各取50μL分別加入等量的包被抗原，混勻，4℃過夜，10000r/min離心30s，同時用商品化抗HPV16L1抗體與抗原VLP共育后點(diǎn)膜，再行免疫檢測，結(jié)果均為陰性。而用 20g/L BSA行相同處理后，檢測結(jié)果為陽性。
2.3 敏感性試驗
隨機(jī)抽取5份陽性血清，用生理鹽水按1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5稀釋，混勻后各取50μL進(jìn)行免疫滲濾法檢測，結(jié)果顯示在1∶4稀釋的血清標(biāo)本仍出現(xiàn)弱陽性。
2.4 穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗
將第5種封閉方法制備的抗原膜片置37℃溫箱2d和室溫保存30d，與放置4℃的抗原膜片對照檢測陽性血清和陰性血清，分批先后作5次試驗，均獲得相同結(jié)果。
3 討 論
免疫反應(yīng)是以其高度特異性為特征，利用免疫反應(yīng)的特異性和敏感性已建立了許多臨床檢測方法。隨著臨床檢測所需樣品的微量化，檢測過程/結(jié)果判讀的快速化，如何保證結(jié)果的特異性就成為最受關(guān)注的問題。以往在免疫細(xì)胞/組織化學(xué)/蛋白印跡染色過程中對消除非特異性染色已有較多的報道，且積累了豐富的經(jīng)驗。在這些實驗中，可以同時兼顧“速度”和“特異性”，為了最大程度獲得特異性，可以多重/長時間處理以消除非特異性著色。但對于臨床檢測，特別是近年來以硝酸纖維素膜為載體的快速免疫分析，除準(zhǔn)確性外，速度成為設(shè)計中最關(guān)鍵的參數(shù)。如何在基于硝酸纖維素膜為載體的快速斑點(diǎn)免疫滲濾分析的蛋白芯片制備過程中同時兼顧快速和特異性，是這一技術(shù)的關(guān)鍵[8]。目前最常用的非特異性染色消除方法是先在載體膜上進(jìn)行點(diǎn)樣，然后應(yīng)用BSA或脫脂奶粉結(jié)合Tween 20、Tween 80、Triton X-100等進(jìn)行封閉。工作中發(fā)現(xiàn)，這些方法雖然有一定的效果，但在封閉后的穩(wěn)定性、重復(fù)性及抗原保存上仍不夠理想[9]。本實驗選擇5種不同的封閉方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以先點(diǎn)膜固相后再封閉，均不能得到理想的效果，而將1g/L的抗原與等體積的20g/L BSA預(yù)先混合，4℃共育過夜，然后固相于NC膜上，其封閉效果極佳，避免了BSA的浪費(fèi)，點(diǎn)樣后的抗原膜室溫保存30d以上仍很穩(wěn)定，且操作方便、靈敏度高、結(jié)果可靠。分析與對照實驗出現(xiàn)誤差的原因，可能是由于抗原的濃度不同而靈敏度也不同，以及與所選用硝酸纖維素膜的性能和質(zhì)量、膜孔徑大小和均一性不同有關(guān)。這些問題有待于進(jìn)一步研究。
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