摘要：目的構(gòu)建人醛固酮合成酶基因(CYP11B2)的真核表達(dá)質(zhì)粒,并在人腎上腺上皮細(xì)胞(NCI-H295R)中表達(dá),為下一步定點(diǎn)突變研究奠定基礎(chǔ)。方法從人的腎上腺組織中提取總的RNA,采用RT-PCR擴(kuò)增法擴(kuò)增人的CYP11B2全長cDNA并克隆到PMD18-T載體中,然后再亞克隆于PcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體,通過菌液PCR和酶切鑒定重組真核表達(dá)質(zhì)粒,并以DNA測序證實(shí)。利用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)體外轉(zhuǎn)染技術(shù)瞬時轉(zhuǎn)染NCI-H295R,RT-PCR和放射免疫法(RIA)檢測CYP11B2基因的表達(dá)。結(jié)果菌液PCR擴(kuò)增和酶切證實(shí)真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功,測序表明CYP11B2基因cDNA全長(1 509bp)和GenBank上公布的序列(D13752)相比較,存在一個堿基差異A3323G,這個變異使得第173位的賴氨酸變?yōu)榫彼?核苷酸序列的同源性為99.9%,氨基酸序列的同源性為99.8%。真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人腎上腺上皮細(xì)胞后CYP11B2 mRNA表達(dá)增加,細(xì)胞上清中的醛固酮含量顯著增加。結(jié)論①通過查閱國外SNP數(shù)據(jù)庫得知K173R為一個SNP位點(diǎn),編號為rs4539。②成功構(gòu)建了人CYP11B2基因的真核表達(dá)質(zhì)粒,陽離子脂質(zhì)體是NCI-H295R有效的體外轉(zhuǎn)染體系,本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究該基因的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。